Western-Blot.docx

Western blot相关试剂哺乳动物蛋白抽提试剂盒：购于北京康为世纪生物科技有限公司（Cat. No. CW0089），蛋白酶抑制剂混合物-20 保存，其他组分室温保存。BCA蛋白定量试剂盒：购于北京康为世纪生物科技有限公司（Cat. No. CW0014），BSA标准品4 保存，其他组分室温保存。2还原型SDS-PAGE上样缓冲液：购于北京康为世纪生物科技有限公司（Cat. No. CW2339），-20 保存。丙稀酰胺 (Acrylamide, Acr)：购于Amresco，室温保存。30%丙烯酰胺溶液：将0.88 g甲叉双丙稀酰胺和29.28 g丙烯酰胺溶解在超纯水中并定容至100 ml，滤纸过滤，4 避光保存。1.5 mol/L Tris-HCl 分离胶缓冲液 (pH8.8)：将18.17 g Tris溶解在超纯水中并定容至100 ml，浓盐酸调pH至8.8，4保存。1.0 mol/L Tris-HCl 浓缩胶缓冲液 (pH6.8)：将12.11 g Tris溶解在超纯水中并定容至100 ml，浓盐酸调pH至6.8，4保存。十二烷基硫酸钠 (Sodium dodecyl sulfate, SDS)：购于Sigma，室温保存。10% SDS溶液：称取10 g十二烷基硫酸钠溶解在超纯水中并定容至100 ml，室温保存。过硫酸铵 (Ammonium persulfate, APS)：购于Sigma，室温保存。10% APS溶液：称取0.1 g过硫酸铵溶解在l ml超纯水中，临用现配。TEMED：购于Amresco，4保存。5蛋白电泳缓冲液：称取93.85 g甘氨酸、15.09 g Tris和5.0 g SDS溶解在超纯水中并定容至1000 ml，室温保存，使用时5倍稀释。预染蛋白marker：购于Fermentas（Cat. No. SM1181；Lot No. 00102717），-20 保存。考马斯亮蓝染色液：称取0.25 g考马斯亮蓝，加入45 ml甲醇、45 m1超纯水和10 ml冰醋酸，混匀，室温保存。脱色液：分别量取45 m1甲醇、45 m1超纯水和10 ml冰醋酸，混匀，临用现配。PVDF膜：孔径为0.22 m，购于Hybond。Whatman 3mm滤纸：购于上海华舜生物工程有限公司。转膜缓冲液：称取5.8 g Tris、2.9 g 甘氨酸和0.37 g SDS，加入200 ml甲醇并用超纯水定容至1000 ml，室温保存。Western Blot膜快速封闭液：购于普利莱基因技术有限公司（Cat. No. P1620），4保存。脱脂奶粉：购于内蒙古伊利实业集团股份有限公司，4保存。抗体稀释液：称取5 g脱脂奶粉溶解于100 ml洗膜缓冲液，4保存。1.0 mol/L Tris-HCl (pH8.0)：将12.11 g Tris溶解在超纯水中并定容至100 ml，浓盐酸调pH至8.0，4保存。洗膜缓冲液：称取8.8 g NaCl，加入20 ml 1.0 mol/L Tris-HCl (pH8.0)和5 ml Tween20搅拌混匀，用超纯水定容至1000 ml，室温保存。Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate：购于Millipore（Lot No. 1227902），4保存。其他试剂均为国产分析纯。SDS-PAGE电泳凝胶按以下配方配制：试剂加样量 (ml)12% 分离胶5% 浓缩胶超纯水4.84.230%丙烯酰胺溶液6.00.991.5 mol/L Tris(pH=8.8)3.91.0 mol/L Tris(pH=6.8)0.7510%SDS0.150.0610%APS0.150.06TEMED0.0060.006总体积15.06.0Western bolt检测细胞中目的蛋白的表达水平总蛋白的提取 选取三瓶生长状态良好且处于对数生长期的细胞，细胞经胰酶消化后收集于EP管中，3,000 r/min离心3 min。弃上清，每支EP管中加入250 l的蛋白抽提试剂（蛋白抽提试剂：蛋白酶抑制剂混合物=99:1），漩涡震荡混匀5 min，冰浴20 min。4，14,000g离心10 min, 将上清液以每管50 l装于PCR管中，-80保存。BCA蛋白定量法测定蛋白浓度1） 稀释BSA标准品：用超纯水按照下表稀释BSA标准品。管号超纯水（l）BSA标准品（l）BSA标准品终浓度（g/ml）A01002000B2002001000C200200（从B管取）500D200200（从C管取）250E200200（从D管取）125F400100（从E管取）25G200002） 配置BCA工作液：根据BSA标准品和待测蛋白样品的数量，将试剂A和试剂B以50:1的体积比混匀。3） 绘制标准曲线：分别将稀释好的A至G管中的BSA标准品分装到干净试管中，每个试管分装100 l，每个浓度做3个平行反应。同样，将适度稀释后的100 l待测样品蛋白也分装入干净试管，每个浓度做3个平行反应。向试管中加入2 ml BCA工作液，充分混匀后置于37水浴箱中孵育30 min。将试管冷却至室温后，用分光光度计测定562 nm处每个样品及BSA标准品的吸光值。以BSA标准品的浓度为横坐标，对应562 nm处的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程。4） 测定并计算样品蛋白浓度：将待测样品蛋白的吸光值带入标准曲线方程得到样品蛋白浓度。SDS-PAGE分离蛋白1) 制胶：将玻璃板依次用纯水和100 % 乙醇擦洗干净，干棉球擦干后安装。配制12%的分离胶15 ml，用移液器将6.5 ml配制好的分离胶沿玻璃板一侧注入两块玻璃板的间隙中，注意不产生气泡。轻柔地在每块胶顶部加入2.0 ml纯水用来阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制，于37孵箱内静置35 min。待凝胶完全聚合后，弃去顶层纯水，配置并加入2.0 ml的5 %浓缩胶，插入1.5 ml梳子，避免产生气泡，于37孵箱内静置35 min。待凝胶完全凝固后，小心拔去梳子，将凝胶从制胶板分离并放入电泳槽内，同时向电泳槽内缓慢注入300 ml 1蛋白电泳缓冲液。每次同时需制两块胶，一块用于考马斯亮兰染色，另一块用于转膜及后续试验。2) 上样：根据蛋白样品的浓度计算出30 g蛋白样品的上样体积，并将相应的蛋白样品与2还原型SDS-PAGE上样缓冲液按体积比1：1混匀。沸水浴5 min使蛋白变性，瞬时离心后用微量移液器将蛋白样品和上样缓冲液混合物加入上样孔。同时在单独的一个上样孔中加入5 l的预染蛋白marker。3) 电泳：恒压80 V，电泳30 min左右，待溴酚兰前缘到达浓缩胶和分离胶的交界面时，将电压提高到l00 V，继续电泳直至溴酚兰前缘距离底边约1.0 cm左右时，停止电泳。小心取出凝胶，切去浓缩胶和多余的分离胶。切好的两块胶一块用于考马斯亮兰染色，一块用于转膜及后续试验。考马斯亮蓝染色将一块切割后的分离胶放置于装有考马斯亮蓝染色液的培养皿中，于脱色摇床上室温均匀摇动40 min。弃去考马斯亮蓝染色液，向培养皿中加入脱色液，于脱色摇床上室温脱色15 min，一共脱色三次。最后可见凝胶中出现均匀的蓝色蛋白条带。转膜和抗体孵育1) 转摸前准备：根据用于转膜的分离胶的大小裁剪出合适的PVDF膜一张和滤纸四张。PVDF膜依次在甲醇中活化30 s，超纯水中浸泡5 min，转膜缓冲液中平衡10 min。四张滤纸和泡沫垫也同时在转膜缓冲液中平衡10 min。2) 制做“凝胶三明治” ：“凝胶三明治”从负极到正极依次为：泡沫垫滤纸两层分离胶PVDF膜滤纸两层泡沫垫，注意排除各层之间的气泡。3) 转膜：将“凝胶三明治”放入转印槽中，加入转膜缓冲液，转印槽周围放上碎冰用来降温。接通电源，恒流200 mA转膜1 h。4) 抗体孵育：取出PVDF膜，可见预染蛋白maker条带，注意区分PVDF膜的正反。Western Blot膜快速封闭液室温封闭PVDF膜1 h；将PVDF膜转入稀释好的一抗中，室温孵育2 h；取出PVDF膜，洗膜缓冲液洗涤3次，每次5 min；再将PVDF膜转入稀释好的二抗中室温孵育1 h，再取出PVDF膜，洗膜缓冲液洗涤3次，每次5 min。5) 曝光成像：分别取Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate试剂盒中的A液和B液各0.5 ml，混匀后均匀滴在PVDF膜上，采用Chemi Doc XRS凝胶成像系统和Image Lab软件采集图像。图像分析与统计处理采用Image J图像分析软件分析结果，测定蛋白条带的绝对积分灰