《食品生物技术》PPT课件.ppt

食 品 生 物 技 术 Food Biotechnology,陈永胜 张继星,食 品 生 物 技 术,主要内容（共八章）： 绪论 基因工程及其在食品工业中的应用 酶工程及其在食品工业中的应用 发酵工程及其在食品工业中的应用 细胞工程及其在食品工业中的应用 生物技术在饮料工业中的应用 生物传感器及其在食品工业中的应用 生物技术在食品工业废水处理中的应用,食 品 生 物 技 术,第一章 绪论 第一节 食品生物技术研究的内容 生物工程及其研究内容 1917年匈牙利工程师Karl Ereky提出（甜菜养猪，利用生物将原料转变为产品） 生物工程：生物工程是一门应用生物科学和工程学原理，来加工生物材料或利用微生物、动物植物体作为反应器及其制备物（细胞或细胞器或某些组成成分如酶）来加工原料以提供产品为社会服务的综合性科学技术。 Biotechnology or Bioengineering,生 物 技 术 的 发 展 历 史,生物技术是一个既古老又年轻的学科。 古老：具有很悠久的历史： 公元前6000年，古代萨马人和巴比伦人已经开始喝啤酒；公元前4000年埃及人烤制发酵面包；创世纪一书问世时，葡萄酒就闻名于近东。发酵乳制品的生产（乳酪、酸奶等）和各种东方食品（如酱油）的生产都具有古老的渊源。日本的香菇的栽培可以追溯到几百年前，伞菇的栽培大约有300年的历史。5000年前我国的酿酒技术已相当精湛。 年轻：现代生物技术开始于20世纪70年代，即基因工程诞生之后。,生 物 技 术 的 发 展 历 史,两个发展阶段： 传统生物工程和现代生物工程 前者主要通过微生物的初级发酵来生产商品，后者以DNA重组技术出现为代表。 三阶段观点： 原始生物工程（第一代生物工程），非纯种微生物发酵工艺为标记； 近代生物工程（第二代生物工程），采用纯种微生物的发酵工艺； 现代生物工程（第三代生物工程），以基因工程诞生为标志。,生 物 技 术 的 发 展 历 史,1857年Pasteur 发现发酵过程是由微生物作用的结果，并因此成为当之无愧的生物工程之父。 人类利用发酵生产是在19世纪，主要产品有乳酸、酒精、面包酵母、柠檬酸和蛋白质及酶等初级产物。 20世纪40年代，以获取细菌的次生代谢物抗生素为主要特征的抗生素工业成为生物工程的支柱产业。50年代氨基酸发酵工业成为生物工程的一个重要组成部分。60年代又增加了酶制剂工业这一新成员。,生 物 技 术 的 发 展 历 史,传统生物技术的三个重要步骤： 第一步：上游处理过程，是指对粗材料进行加工，作为微生物的营养和能量来源； 第二步：发酵和转化，即在大的生物反应器（100L）大量生长微生物来生产某种产品，如抗生素、氨基酸或蛋白质等； 第三步：下游处理，对所需的目的产物的分离纯化。 传统生物技术研究主要目标：最大限度提高这三个步骤的整体效率，同时寻找可以制备食品和食品添加剂和药物的微生物。,生 物 技 术 的 发 展 历 史,研究内容： 生物转化环节的优化：菌种的选育和改良，包括化学突变、诱变或紫外线照射来产生突变体，通过选择来改良菌株，提高产量（例如抗生素的大量生产）。 生物反应器的设计、发酵过程的检测和反应体系的检测技术 下游产品的分离纯化技术 局限性： 提高产量的幅度有限（突变株某一组分合成太多影响其它组分的合成进而影响微生物在大规模发酵过程的生长）； 诱变和选择方法过程烦琐，耗时长，费用极高需筛选和检测大量的克隆； 只能提高已有的遗传性质不能赋予其他新的遗传性质。 传统的生物技术仅仅局限在化学工程和微生物工程的领域。DNA重组技术的出现和发展引发的根本性的改变，即现代生物技术的时代的到来。,DNA 重组技术的出现标志着现代生物技术的开始； 1953年，Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构，奠定了现代分子生物学的基础，给整个生物学乃至人类社会带来了一场革命。 1973年Herber Boyer和Stanley Cohen完成人类历史第一次有目的的基因重组尝试（pSC101，EcoRI, T4-DNA ligase）；并据此提出了“基因克隆”的策略。,现 代 生 物 技 术 内 容,生物转化的环节更为有效，不仅可以分离得到高产菌株，还可以人工制造高产菌株； 原核生物化和真核生物都可以表达大量的外源蛋白（胰岛素、病原抗原等），动植物也可以作为天然的生物反应器； 大大简化新药的开发和监测系统；,现 代 生 物 技 术 内 容,基因工程（Gene Engineering） 细胞工程（Cell Engineering ） 酶工程（Enzyme Engineering ） 发酵工程（Fermentation Engineering ） 蛋白质工程（Protein Engineering ）,现 代 生 物 技 术 内 容,基因工程：把生物体的遗传物质（通常为DNA）分离出来在体外切割、拼接和重组。然后把重组DNA导入宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传性质或使新的遗传信息大量表达以获取基因产物。也称DNA重组技术。 细胞工程：指以细胞为单位，在体外进行培养和繁殖或使细胞某些生物学特性按人们的意志发生改变，从而改良生物品种和创新品种，加快繁殖个体或获得某种有用物质的过程。 细胞工程应包括动植物细胞的体外培养、细胞融合技术（细胞杂交技术）、核移植技术等,现 代 生 物 技 术 内 容,酶工程：利用酶、细胞器或细胞特有的催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的技术。 包括酶的固定化技术、细胞固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计等。 发酵工程：利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊的特点，在合适的条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物（或动植物细胞）的某种特定功能生产人类所需的产品。过去也称微生物工程。,现 代 生 物 技 术 内 容,蛋白质工程：指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质。 基因工程和细胞工程特别是基因工程现代生物技术的核心，它们给传统的酶工程和发酵工程注入了新的活力。,现 代 生 物 技 术 内 容,基因工程,微生物,动植物个体或细胞,工程菌,蛋白质或酶,发酵过程,蛋白质工程或酶工程,细胞工程,优良的动植物品系,产品,现代生物技术内容之间的关系,现 代 生 物 技 术 内 容,基因工程是基础，而所以基因工程的结果都要通过生物体本身或其细胞（生命活动的基本结构和功能单位）内的酶（或发酵）作用而表现出来。因此，细胞工程是最基本的生物工程技术。 蛋白质工程与基因工程关系密不可分。不同的是基因工程操作单位是整个基因，而蛋白质工程的操作是一个或一些碱基。,现 代 生 物 技 术 与 其 它 学 科 的关 系,现代生物技术是生物学与工程学原理综合交叉的边缘学科，亦为知识和技术密集型学科。本学科既是应用生命活动的基本原理，则必需掌握生物体结构、功能、代谢活动及其规律等有关知识，因此与细胞生物学、分子遗传学、微生物学、生理学、生物化学、生物物理学，甚至与物理学、化学及数学等基础学科均有密切关系。同时工程化要求掌握生物反应器的构造原理、生物反应工程原理、物质传递规律、设备运转及其控制条件等基本知识，故与化学工程原理、发酵工程、生物化学工程、电子工程、材料科学、计算机科学及信息科学等密切相关。,现 代 生 物 技 术 的 特 点,高效和经济 清洁、低耗和可持续发展 可遗传、易扩散与自主扩展 对人类伦理和人性尊严有直接影响（如克隆人）,现 代 生 物 技 术 内 容,根据研究领域和内容： 农业生物工程 食品生物工程 医药生物工程 海洋生物工程. ,现 代 生 物 技 术 的 发 展 趋 势,基因操作技术日新月异，不断完善，从发明到应用时间不断缩短； 基因工程药物和疫苗研发（RD）突飞猛进，将全面更新21世纪的医药工业； 转基因植物和动物取得重大突破，在21世纪将给农业畜牧业带来新的飞跃； 诠释生命的本质阐明生物体（如人类、水稻、拟南芥等）基因组及其编码的蛋白质的结构与功能是生物科学发展的一个主流方向，与人类重大疾病和农作物产量、质量、抗性等有关的基因结构与功能的研究是今后一个时期的热点和重点； 基因治疗取得重大进展，有望革新整个疾病的预防和治疗领域，21世纪可能在恶性肿瘤、艾滋病等方面有所突破； 蛋白质工程形成了一门高度综合的学科（分子生物学、结构生物学、计算机技术等） 。 生物信息学广泛深入发展，信息技术渗透到生命科学领域之中。,生物技术对社会发展的影响,1 改善农业生产、解决粮食短缺） 2 提高生命质量，延长人类寿命 3 解决能源危机、治理环境污染 4 制造工业原料、生产贵重金属 人口、资源（包括能源）、粮食、环境是人类面临的最重大的问题,生物技术对社会发展的影响,1 改善农业生产、解决粮食短缺（民以食为天） 1.1 提高农作物的产量和品种 培育抗逆的作物优良品系 植物种苗的工厂化生产 提高粮食品质 生物固氮，减少化肥使用量（减少了能耗和环境污染） 1.2 发展畜牧业生产（丰富人们的饮食生活） 动物的大量快速繁殖 英国的Roslin研究所培育出“多莉”（1997年2月绵羊乳腺细胞） 培育动物的优良品系 很多转基因动物，羊、猪、鱼, 转基因鼠（1983，美 国大鼠的生长素基因导入小鼠的受精卵）,生物技术对社会发展的影响,提高生命质量，延长人类寿命（医药生物技术发展最迅速、效益最显著） 开发生产奇特又贵重的药品 疾病的预防和诊断 基因治疗 人类基因组计划,生物技术对社会发展的影响,3 解决能源危机、治理环境污染 解决能源危机 杂草木屑植物秸秆等生产乙醇； 微生物发酵产生沼气或氢气 提高石油开采率 环境保护 利用苏云杆菌生产毒蛋白代替农药 微生物降解各种污染物 4 制造工业原料、生产贵重金属 氨基酸类，酸味剂，甜味剂和化学工业原料如乙醇丙酮、丁醇等及重要原料如癸二酸（尼龙、香料）、丙烯酰胺（石油开采）、以康酸（合成树脂、纤维、塑料）2,3-丁二醇（橡胶）和长链二羧酸（工程塑料、树脂）,生物技术的商业化的特点,属于典型的技术密集型产业 市场迅速扩张 世界各国都投入了巨额资金 有关产品不断增加，且增加速度在加快 有关经营公司竞争激烈 每一个公司研究目标日趋集中，产品更加专一 医学生物技术产业化进程最快,中国面临的现代生物技术R D的挑战,过多的仿制 低水平的重复 专业和管理人才短缺,食 品 生 物 技 术 第一节 食品生物技术研究的内容,为什么学习食品生物技术？ 21世纪为生物工程的世纪 生物工程与电子信息和新材料技术被列为当今极为重要的三大高新技术。 与食品科技的关系十分密切（从传统生物技术和现代生物技术来看都是如此，从油盐酱醋，到转基因动物和植物及它们的安全性）,食 品 生 物 技 术 第一节 食品生物技术研究的内容,食品生物技术：主要是指生物技术在食品工业上的应用。 基因工程：以DNA重组技术为手段，改良食品原料和食品微生物。或者对蛋白质分子定位突变，提高食品的营养价值。（转基因植物与动物） 细胞工程：应用细胞生物学原理，有目的地改造遗传物质和细胞培养技术，通过细胞融合技术和动植物细胞（一般不包括微生物细胞）大量培养，来生产各种原来含量少和全新的保健食品有效成分、新型食品和食品添加剂。（鹿茸细胞和人参细胞的培养）,食 品 生 物 技 术 第一节 食品生物技术研究的内容,酶工程：利用酶与细胞的固定化技术和酶的催化活性提高食品生产过程中的物质转化，以提高效率和降低成本。（葡萄糖果糖异构酶，酸奶） 发酵工程：采用现代化发酵设备和控制技术对改造后的菌株进行放大培养和控制性发酵，获得工业化生产预订的食品和食品的功能成分。（如味精即谷氨酸钠盐）,食 品 生 物 技 术,主要参考书： 1，现代生物技术导论，瞿礼嘉等编，高等教育出版社，1998 2，生物技术概论，宋思扬，楼士林 主编，科学出版社，2001 3，生物工程与生命，罗琛 主编，科学出版社，2000 4,食品生物技术导论，罗云波，生吉萍。化学工业出版社，2006,食 品 生 物 技 术 第二节 分子生物学研究进展,一、基因的本质 分子遗传的功能单位，DNA分子上的一个片断。 二、DNA的结构与功能 A（腺嘌呤）,G（鸟嘌呤）,C（胞嘧啶）,T（胸腺嘧啶） 脱氧核糖+碱基+磷酸基=核苷酸，核苷酸聚合 核酸 1953年，Watson Crick, 双螺旋模型 3，5 磷酸二酯键，氢键，配对原则：A与T， C与G 遗传基因载体（携带遗传信息） 半保留复制 遗传信息保存和传递的基础（DNA转录合成RNA，mRNA翻译蛋白质）。 三、RNA的结构与功能 核糖， A, G, C, U, 单链 三类：rRNA： 存在于核糖体(大肠杆菌中占2，稳定) tRNA： 在蛋白质的合成中运转氨基酸(大肠杆菌中占16，稳定) mRNA：遗传信息，其核苷酸序列决定了蛋白质的氨基酸序列(大肠杆菌中占82，稳定),食 品 生 物 技 术 第二节 分子生物学研究进展,四、蛋白质的生物合成 主要参予者：tRNA、核糖体和mRNA等 （1）氨基酸活化成氨基酰tRNA （2）tRNA的反密码子与mRNA的三联体密码子配对。mRNA核苷酸顺序决定了蛋白质氨基酸顺序 （3）新链的生成方向为氨基端向羧基端。 （4）过程复杂，有很多酶、ATP或GTP及起始因子、延长因子和终止因子等因素参与。,食 品 生 物 技 术 第二节 分子生物学研究进展,五、蛋白质合成的调节 操纵子：结构基因操纵基因启动子基因 酶的诱导合成（诱导物（底物）通过与阻遏蛋白结合解除对酶合成的抑制而诱导酶的合成，如乳糖操纵子） 酶合成的反馈阻遏（酶作用后的最终产物抑制酶的合成，终产物与阻遏物结合为共阻遏物阻止酶的合成） 分解代谢对酶合成的阻遏作用（分解代谢物阻遏某种蛋白质的合成，如葡萄糖效应） 控制酶活性的反馈抑制（终产物反过来抑制反应链的第一个酶的活性，而不是阻遏酶的生成）,食 品 生 物 技 术 第二章 基因工程及其在食品工业中应用,第一节 工具酶 一、限制性内切酶裁缝的剪刀* I 型和II酶，基因工程主要使用的为II型（有的分为三类）。 II型，识别序列短，切割位点位于识别序列内（或附近）。识别位点具有旋转对称结构（逥文结构）。单功能酶，仅具有限制作用。 命名：属名和种名相结合的原则，即属名第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）形成三字母缩写（斜体）。若同株菌含有几种酶，则分别用罗马数字置于三字母之后如HaeI和HaeII。当有株名或血清型时，把株名或血清型的第一个字母放在三字母之后。如HindII及HindIII，EcoRI 产物：粘性末端和平头末端(二者5端都是P基团，3端都是OH) 切割后形成异源二聚体,食 品 生 物 技 术 第二章 基因工程及其在食品工业中应用,第一节 工具酶 二、连接酶裁缝的针线（缝纫机）：大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶，前者NAD作辅助因子，只能连接具有互补粘性末端的DNA片断；后者ATP作辅助因子，既可以连接互补的粘性末端的DNA片断，也可以平头末端的分子。即后者的连接活性高于前者。 三、DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸聚合的酶：缺口翻译标记和酶法DNA测序（该酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶，即以DNA作模板合成DNA） 四、碱性磷酸酯酶偷走别人校徽（去除5的磷酸基团产生5OH，防止载体自我环化可以提高重组效率及为5 标记作准备） 五、T4多聚核苷酸激酶给人挂上校徽（加上5磷酸基团，用于5 末端标记） 六、S1核酸酶专门欺负弱者的人（降解单链，除去单链形成钝端和打开cDNA合成中的发夹状环） 七、逆转录酶反客为主的人（从RNA到DNA，因此称为依赖RNA的DNA聚合酶，即RNA为模板合成DNA）,食 品 生 物 技 术 第二章 基因工程及其在食品工业中应用,第二节 目的基因 目的基因的来源： 生物学途径：shotgun 和分子杂交 酶促合成 化学合成,食 品 生 物 技 术 第二章 基因工程及其在食品工业中应用,第三节 分子克隆载体 基本要求： 1、能够自我复制（携带外援基因前后） 2、相对质量要小，具有合适的酶切位点 3、具有有效的运载能力，能携带大小不同的外源性基因。 4、能给宿主提供便于选择的标记或表征特性 种类：质粒，噬菌体，柯斯质粒（cosmid），YAC载体（yeast artificial chromosome）等,食 品 生 物 技 术 第二章 基因工程及其在食品工业中应用,第四节 基因重组 原理：T4 DNA连接酶形成3，5 磷酸二酯键 连接方式(P22,图2-1)： 粘性末端连接：直接连接和加尾连接（既可以用大肠杆菌DNA连接酶,也可以用T4 DNA连接酶） 平头末端连接（只能用T4 DNA连接酶） *平头末端的连接效率低于粘性末端连接效率。 *加尾连接法是在没有粘性末端的情况下为提高连接效率人为的创造可配对的末端。一种分子用AAA, 另一边用TTT.或者一边用CCC., 另一边用GGG.,食 品 生 物 技 术 第二章 基因工程及其在食品工业中应用,第五节 转化、增殖和表达 转化：将携带某种遗传信息的DNA分子引入宿主细胞，通过DNA之间同源重组获得具有新遗传性状生物细胞的过程。英文为transformation，转化为DNA的单方向转移，即外援DNA进入受体细胞，而不是交换。 一、受体细胞： 定义：在转化、转导和杂交过程中接受外源基因的细胞。 要求：具有接受外源基因的能力。 内切酶缺陷性或DNA重组性菌株 安全,在人体内和离开特定的培养条件 无法繁殖. 种类:细菌,放线菌,酵母,哺乳动物细胞和植物细胞,食 品 生 物 技 术 第二章 基因工程及其在食品工业中应用,第五节 转化、增殖和表达 二、感受态和感受态细胞 感受态：受体细胞能够吸收外源DNA分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。一般受体细胞在对数生长期转化能力最强。还与重组DNA分子的构型和大小有关。分子量越小越易转化。 三、扩增筛选 阳性转化子筛选： 表现型分析法（如插入失活,如P30 图22） 原位杂交法 免疫分析法 PCR技术（PCR 聚合酶链式反应） 目的基因的扩增： 通过转化受体细胞扩增, 受体细胞转化繁殖后就实现了扩增。 聚合酶链式反应（PCR， polymerase chain reaction） 四、基因表达：目的基因在受体细胞内转录翻译为相应的蛋白质或酶，或进而获得它们的代谢产物的过程。 启动子和表达载体 一般使用强启动子，如lac启动子， trp启动子等 真核生物还需要SD顺序（Shine-Dalgarno sequence, 核糖体的一个结合位点)，另一个为ATG即起始密码子。,食 品 生 物 技 术 第二章 基因工程及其在食品工业中应用,第六节 基因工程及其在食品工业中应用 一、改良食品加工原料 如基因工程生产的生长素注射牛和猪；提 高植物油中不饱和脂肪酸的含量;延缓疏果成熟，提高抗病抗逆能力及加工性能等 二、改良微生物菌种性能 转基因改良的面包酵母，啤酒酵母和转基因的大肠杆菌，以及用于生产食品添加剂和加工助剂的改良菌株 三、应用于酶制剂的生产 重组DNA技术生产小牛凝乳酶；耐热的-淀粉酶；糖化酶基因在酵母中表达和SOD在酵母和大肠杆菌中的高效表达等 四、改良食品加工工艺 克隆基因降低大麦中的醇溶蛋白，利于啤酒的生产；提高牛奶的热稳定性。 五、生产保健品的有效成分 鹿茸、牛黄的人工培养和人参细胞的培养；人的血红素基因转到猪中，用猪生产人血的替代品等。,食 品 生 物 技 术 第二章 基因工程及其在食品工业中应用,第七节 蛋白质工程 一、 基因修饰改造蛋白质结构 定位突变（P35和图2-3） 盒式突变 二、蛋白质工程的应用 溶菌酶稳定性的改造，葡萄糖异构酶最适pH的改变；单克隆抗体的“人类化”,食 品 生 物 技 术 第二章 基因工程及其在食品工业中应用,第八节 基因工程食品卫生安全管理规范 美国提供给消费者基因工程食品有三种：动物用药、完整的食物和食品添加剂。 英国基因工程食品四类标准： 采用基因工程菌生产的与传统食品质量和成分相同； 食品内容含有与自身同种基因的基因工程菌生产的食品； 食品中含有别的基因工程菌的成分； 食品含有别的基因工程菌，而这种菌含有别的物种基因。 * 前两种无需标示，后两类则需要标示出来。,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,酶是一类生物催化剂，其催化活性是由其特定的空间结构决定的。酶分子具有活性中心（对催化作用特别重要的极小的空间和区域，往往由几个氨基酸组成），包括结合部位和催化部位。前者处于底物结合部位，决定酶的专一性，后者决定酶的催化类型和性质。具有调节作用的酶还有“别构部位”。这是酶的抑制剂或活化剂的结合部位。 酶作用具有高度专一性、催化效率高、活性调节控制机制复杂、在常温常压和生理条件下行使功能。,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,酶工程：应用酶的特异的催化功能并通过工程化为人类生产有用产品和提供有益服务的技术。 从动植物体及微生物发酵物中制取的酶称为第一代酶(已形成一定的产业规模)。固定化酶称为第二代酶（已得到推广应用）；固定化生长态细胞和多酶体系及固定化辅酶称为第三代酶（已实现工业化）。后二者称为现代酶工程。 酶工程是研究酶的生成和应用的一门技术性学科，包括酶制剂的制备、酶的固定化、酶的修饰改造及酶反应器等方面的内容。,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,酶的来源：生物界有3000多种酶，来源有动植物组织（如来自动物的胰蛋白酶和来自植物的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶）， 大多数来自微生物及其发酵液（葡萄糖异构酶、枯草杆菌蛋白酶等）。微生物包括细菌、真菌、放线菌、霉菌、酵母等。,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,固定化酶及其特性 固定化酶：限定或位于特定空间的酶，又称固着酶（Immobilized enzyme）。固定化酶属于修饰酶（与天然酶对应），修饰酶还包括蛋白质工程技术改良的酶。 固定化酶有包埋型及结合型（酶结合在载体上）。包埋型有凝胶包埋及微囊化包埋两类；结合型又分为吸附与共价两种。,固定化酶,包埋型,结合型,凝胶包埋,微囊化包埋,吸附结合型,共价结合型,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,固定化酶的优点（可溶性的酶变为不溶于水的酶）： 稳定性高于天然酶 反应后酶与底物易于分开，并可长期反复利用 反应液中无残留酶，产物易于纯化，产品质量高 可实现转化反应连续化和管道化和自动控制生产 酶的利用率高，降低了生产成本 转化过程基本上无三废排出（被称为 “无公害酶” ）,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,固定化细胞及其特性 固定化细胞：被限制或定位于特定空间位置的细胞（与固定化酶一起统称固定化生物催化剂）。此技术已扩展至动植物细胞甚至线粒体和叶绿体等细胞器的固定化。其应用比固定化酶更为普遍。 固定化细胞的特点：无需进行酶的分离纯化，减少投资； 细胞保持原初生命状态，固定化过程酶回收率高； 细胞内酶较固定化酶稳定性更高； 细胞内辅助因子可以自动再生； 细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应； 抗污染能力强。,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,细胞固定化方法： 载体结合法：吸附法和共价结合法 包埋法（凝胶或微囊） 交联法（cross linking） 选择性热变性（在适当温度下使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定在细胞内）,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,酶法应用于纤维素的水解 纤维素大量广泛存在，加强综合利用和提高利用效率对净化环境和开辟新能源等意义重大。纤维素酶是降解纤维素成葡萄糖的一组酶的总称（不是一种单一纯酶）即包括多种水解酶，是一种复合酶。 一般分为三类： 葡萄糖内切酶（endo-1,4-D-glucanase,EG），产物为非还原末端的小分子纤维素 葡萄糖外切酶（exo-1,4-D-glucanase）,又叫纤维二糖水解酶（cellobiose hydrolase，CBH），产物纤维二糖分子。 -葡萄糖苷酶（-glucosidase，BG）底物为纤维二糖和纤维寡糖，产物为葡萄糖。 产酶菌种：细菌、放线菌、真菌和酵母,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,测定纤维素酶活力的方法：滤纸崩溃法，棉花糖化力，CMC糖化力（以还原糖表示），CMC液化力（以粘度表示）和滤纸糖化力等。其中， CMC糖化力主要代表外切-1,4-葡萄糖酶的活力和内切酶活力的总和； CMC液化力主要代表内切- 1,4-葡萄糖酶活力；滤纸糖化力代表“纤维素糖化”酶活力或总纤维素的酶活力。 *CMC（carboxyl methyl cellulose）:羧甲基纤维素 *HEC ( hydroxy ethyl cellulose) :羟乙基纤维素,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,影响纤维素酶作用的因素：底物、酶组成、pH、温度和抑制剂和活化剂。 纤维素酶在食品工业中的应用P4748 1.果汁生产：促进果汁提取与澄清。果皮渣酶解转化为可溶性糖和降解为短链低聚糖即膳食纤维。 2.香料生产：利于香料在提取液扩散与分配，增加得率和产量。 3.果蔬生产：提高可消化性改进口感和脱水蔬菜的烧煮性和复原性。 4.种子蛋白利用：增加大豆或豆饼水溶性蛋白质的得率，缩短时间，提高质量。 5.速溶茶生产：提高得率保持原来的色、香、味，缩短提取时间，提高水溶性较差的茶单宁和咖啡因的提取率。 6.可发酵糖的生产：糖化酶处理产生可供微生物发酵利用的碳源，来生产酒精和单细胞蛋白。对利用丰富的纤维素资源意义重大。 7.琼脂生产：提高得率，简化工艺，避免琼脂的分解。,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,纤维素酶在发酵工业中应用的两种方式：一种先糖化再经微生物发酵生产；另一种是在加入纤维素酶的同时接种用于微生物发酵。后一种解除了第一种方式中降解产物（如葡萄糖）对纤维素酶的抑制作用，提高了产量。主要应用于酱油酿造、制酒工业和纤维素废渣转化利用。 酶法应用于淀粉糖类的生产P4862 酶法生产新型低聚糖 酶法应用于干酪产品生产 酶法应用于环壮糊精的生产 其它酶在食品加工中的应用,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,第二节：酶法应用于淀粉糖类的生产 -淀粉酶：底物淀粉，作用位置底物内部随机-1,4糖苷键，产物为分子量不等的糊精和少量低聚糖和麦芽糖和葡萄糖。不水解支链淀粉的-1,6糖苷键和靠近分枝点-1,6糖苷键外的-1,4糖苷键。工业上称为液化型淀粉酶。随淀粉分子分子量变小，水解速度变慢，底物分子量越小，水解速度越慢。钙离子对保持酶的最大活性与稳定性和适当的构像很重要。 来源：动物、植物和微生物，工业-淀粉酶主要来自细菌和曲霉。细菌芽孢杆菌，特别是耐热性的-淀粉酶。,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,-淀粉酶：底物为淀粉，位点为非还原端，产物两个葡萄糖单位并把原来的构型转化为构型。特点只水解-1,4糖苷键，不水解-1,6糖苷键，因此水解支链淀粉不完全，产生较大的极限糊精和生成5060的麦芽糖。 广泛存在于植物和微生物中，生成-淀粉酶的微生物主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌、放线菌等。工业上主要以植物为主生产麦芽糖。,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,葡萄糖淀粉酶：作用于淀粉的非还原端依次水解一个葡萄糖分子并把构型转变为构型。可以水解-1,4糖苷键、-1,6糖苷键 和-1,3糖苷键 脱枝酶：作用于支链淀粉、糖原的分枝点的-1,6糖苷键。与淀粉酶一起来制造麦芽糖可使麦芽糖的得率从5060提高到90；与糖化酶一起可将淀粉转化为葡萄糖的得率提高到90以上。,食 品 生 物 技 术 第三章 酶工程及其在食品工业中应用,果糖糖浆 的生产分为淀粉液化、糖化和葡萄糖异构化几个工序。 超高麦芽糖的生产也包括液化、糖化阶段，其中糖化可以利用糖化型淀粉酶糖化，也可以利用淀粉酶和脱枝酶协同糖化。 麦芽糖的精制的方法有吸附分离法（活性炭柱精制法和阴离子交换树脂法）、有机溶剂沉淀法、膜分离法（超滤、反渗透）、结晶法等方法。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,发酵工程：利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊的特点，在合适的条件下，通过现代化工程技术手段和微生物（或动植物细胞）的某种特定功能生产人类所需的产品。过去也称微生物工程（由于以培养微生物为主）。 发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节，它将微生物学、生物化学和化学工程的基本原理有机地结合起来，是一门利用微生物的生长和代谢来生产各种有用物质的工程技术。 发酵技术有着悠久的历史。发酵（fermentation），来自拉丁语发泡（fervere），是指酵母作用于果汁或发芽谷物产生CO2的现象。巴斯德研究酒精发酵的生理意义，认为发酵是酵母在无氧状态下的呼吸过程。生物化学上的定义为“微生物在无氧状态的呼吸过程”。目前，把利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来准备微生物体或其代谢产物的过程统称为发酵。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,从开始的酿酒、制酱、制奶酪， 到40年代抗生素工业的兴起，再到在传统发酵的基础上结合了现代DNA重组、细胞融合、分子修饰改造等新技术的现代发酵技术。 优点：投资省，见效快、污染小、外源目的基因在微生物菌体中高效表达等。 发酵产品的产量与初期相比，至少增加了几十倍。发酵生产的抗生素品种高达200多个，发达国家发酵工业的产值占国民生产总值的5。在 医药行业占20。涉及到许多领域。 发酵过程主要内容包括生产菌株的选育，发酵条件的优化与控制，反应器的设计及产品的分离、提取与精制等。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,目前已知具有生产价值的发酵类型有以下五种：,微生物菌体的发酵，比较传统的菌体发酵工业，有用于面包制作的酵母发酵及用于人类或动物食品的微生物菌体蛋白（即单细胞蛋白，SCP）发酵两种类型。新的菌体发酵可用来生产一些真菌，如香菇类、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌、与天麻共生的密环菌以及从多孔菌科的茯苓菌获得的名贵中药茯苓和担子菌的灵芝等药用菌。有的微生物菌体还可用作生物防治剂，如苏云杆菌。 微生物酶发酵，目前工业上应用的酶大多数来自微生物发酵。因为微生物具有种类多、产酶的品质多、生产容易和成本低等优点。如微生物生产的淀粉酶和糖化酶用于生产葡萄糖。 微生物代谢产物发酵，包括初级代谢产物（在菌体对数生长期的产物，如氨基酸、核酸、蛋白质、糖类等（这些在食品工业具有相当的重要性，分别形成不同的发酵产业）和次级代谢产物（在菌体生长的静止期合成，是一些具有特定功能的产物如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等）。前者是菌体生长繁殖所必须的。后者和菌体的生长繁殖无明显关系。特别是抗生素的发酵已成为发酵工业的重要支柱。 微生物的转化发酵，利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变为结构相关的更有经济价值的产物。如菌体将乙醇转化为醋酸的发酵。 生物工程细胞的发酵，指利用生物工程技术所获得的细胞进行培养的新型发酵，如基因工程菌生产胰岛素、干扰素、青霉素酰化酶等，杂交瘤细胞生产单克隆抗体等,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,菌种的筛选的标准即菌种需具备的特性： 1，稳定而高产的遗传特性； 2，抗噬菌体能力强； 3，发酵过程泡沫少； 4，需氧量低； 5，底物转化率高； 6，对培养物和前提耐受力强； 7，营养特性和发酵过程可用廉价原料为培养基； 8，最适温度高； 9，既具有高的遗传稳定性又要有基因操作可修饰性； 10，产物易于从发酵液中回收。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,微生物的发酵过程：根据微生物的种类不同（好氧、厌氧、兼性厌氧），可分为好氧性发酵和厌氧性发酵两大类。 好氧性发酵，在发酵过程中需要 不断地加入一定量的无菌空气，如利用黑曲菌进行柠檬酸的发酵、利用棒状杆菌进行的谷氨酸的发酵和黄单胞菌进行多糖的发酵等等。 厌氧性发酵，不需要供给空气，如乳酸菌引起的乳酸发酵、梭状芽孢杆菌引起的丙酮、丁醇发酵等， 兼性厌氧，酵母菌是兼性厌氧微生物，在缺氧条件下厌氧性发酵积累酒精，而在有氧条件下则进行好氧性发酵，大量繁殖菌体细胞。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,按照设备来分：敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵和深层发酵。 敞口发酵，设备要求简单，用于繁殖快并进行好氧性发酵的类型，如酵母的生产。由于酵母的迅速大量的生产抑制了其它杂菌的生长。 密闭发酵，设备要求严格，工艺复杂。 浅盘发酵，一薄层培养液，接种后在液体上面形成一层菌膜。用于繁殖快好氧性微生物的培养。 深层发酵，在液体培养基内部（不仅仅在表面）进行微生物的培养。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,深层发酵具有很多优点：,液体悬浮状态是微生物最适的生长环境； 液体中菌体及营养物、产物易于扩散，发酵在均质或拟均质的条件下进行，便于控制，易于扩大生产规模； 液体输送方便，易于机械化操作； 厂房面积小，生产效率高。易于自动化控制，产品质量稳定； 产品易于提取、精制等。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,发酵工业常用的微生物： 细菌（枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌、短杆菌，用于淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等的生产） 放线菌（主要来自其下的链霉菌属、小单胞菌属和诺卡氏菌属。抗生素的60是由放线菌生产的） 酵母菌（啤酒酵母、假丝酵母、类酵母，用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶，可食用、药用和饲料用的酵母菌蛋白） 霉菌（藻状菌纲的根酶、毛霉、梨头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等，用于酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素的生产） 其它微生物（担子菌即通常所说的菇类微生物，如香菇多糖，灵芝多糖类物质都有抗癌作用；藻类，如螺旋藻）,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,培养基的种类和组成 培养基的种类： 孢子培养基，供制备孢子用，要求：形成大量优质孢子但不能引起菌株变异。基质浓度特别是有机氮源要低些，无机盐的浓度要适当 菌种（种子）培养基，供孢子发芽和菌体生长繁殖用，营养成分比较丰富完整易吸收，氮源和维生素含量应略高些。 发酵培养基，供菌体生长繁殖和合成大量代谢物，要求营养成分丰富完整，浓度和粘度适中。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,培养基的组成： 碳源：单糖（如葡萄糖、果糖）、双糖（如蔗糖、麦芽糖）和缓慢利用的淀粉和纤维素等。其中，玉米淀粉及其水解液常用于抗生素、氨基酸、核苷酸、酶制剂等的发酵；马铃薯、小麦、燕麦淀粉等用于有机酸、醇的发酵生产。有些有机酸、醇作在单细胞蛋白、氨基酸、维生素、麦角碱和某些抗生素的发酵碳源。有些石油产品作为微生物发酵的主要原料。 氮源：有机氮（黄豆饼、棉子饼、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等）和无机氮源（硫酸铵、氯化铵和硝酸铵等） 无机盐和微量元素：功能为构成原生质体的成分（如磷硫等）、作为酶的组成成分和维持酶的活性（镁、铁、锰、锌钴等）、调节细胞的渗透压和影响细胞膜的透性（氯化钠、氯化钾等）和参与产物的生物合成等。微量因素一般有0.1ppm浓度就可以满足要求。 生长因子：维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物等。 水：深井水、自来水和地表水 产物形成的诱导物、前体和促进剂：许多胞外酶的合成需要适当的诱导物存在。前提是指被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质。当前体物质的合成是产物合成的限制因素时，加入前体可以增加产物的产量和在某种程度上控制生物合成的方向。加入促进剂可刺激菌株的生长，提高发酵产量，缩短发酵周期。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,发酵工程的一般过程：,菌株的纯化育种：菌株来源有三种途径：a,从自然界分离筛选;b. 从菌株保存机构已知菌种中分离；c. 从生产过程中分离筛选，包括基因工程手段改造工程菌。还需要定期对菌株纯化和育种。 种子的扩大培养：是个逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯种培养物称为种子。 发酵：发酵过程的中心环节，所用的培养基和培养设备都必须灭菌，通入的空气或中途补料都是无菌的，转移种子也要常用无菌培养技术。 下游处理：指发酵结束后对发酵液或生物细胞进行分离和精制，制成符合要求的产品。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,发酵的方式：,分批发酵：营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排除外，与外部没有物料交换。传统的生物产品的发酵多用此过程。除了控制温度和pH及通气以外，不进行其他控制，操作简单。从细胞所处的环境来看，则变化明显，发酵初期营养物过多，可能抑制微生物的生长，而中期又因营养物减少而降低培养效率。从细胞增殖来说，初期细胞浓度低，增长慢，后期细胞浓度虽高，但营养物浓度过低也长不快，总的生产能力不高。（画图表示六个时期的生长曲线：延滞期、短暂的加速期、指数生长期、减速期、稳定期和衰亡期），分批发酵属于封闭系统。 连续发酵：指以一定的速度向发酵灌内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液， 从而使发酵灌内的液体量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。稳定状态可以有效地延长分批培养中的对数期。微生物所处的环境条件，如营养物的浓度、产物浓度、pH值等保持稳定，微生物细胞的浓度及其比生长速率也可维持不变。甚至可根据需要调节。 补料连续发酵：又叫半连续发酵，介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定的物料的培养技术。通过补充物料，可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证了微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而提高了产率。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,连续发酵的优缺点（与分批发酵相比）：,优点： 维持稳定的操作条件，利于微生物生长代谢，产率和产品质量也保持稳定； 更有效地实现机械化和自动化，降低劳动强度，减少操作人员与病原微生物和毒性物质接触的机会； 减少了设备清洗、准备和灭菌等非生产占的时间，提高设备利用率； 延长了仪器探头的寿命（由于灭菌次数的减少）； 容易对过程进行优化，有效提高发酵产率。 缺点： 容易造成污染（由于系统开放和发酵周期长）； 对设备、仪器及控制元器件的技术要求高； 粘性丝状菌菌体容易附壁上生长和在发酵液里结团，给连续操作带来困难。 连续发酵技术目前主要用于理论研究，基本上未进行实际应用。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,两种补料分批发酵：,单一补料分批发酵，开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始补加碳源和（或）氮源或（和）其他必需基质，直到发酵液的体积达到发酵灌最大操作容积后，停止补料，最后发酵液一次全部放出。由于受发酵灌操作容积的限制，发酵周期只能控制在较短的范围内； 反复补料分批发酵，在单一补料分批发酵的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，使发酵液的体积始终不超过发酵灌的最大操作容积，延长发酵周期，直至发酵产率明显下降，才最终将发酵液全部放出。既保留了单一补料分批发酵的优点，又避免了它的缺点。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,补料分批发酵的优点： 补料分批发酵是分批发酵向连续发酵的过渡，兼有两者的优点，又克服了两者的缺点。与分批发酵相比，首先可以解除营养物基质的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。对于好氧发酵，可以避免分批发酵中一次性投入糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，导致通风设备不能匹配的状况。还可以减少菌体生长量，提高有用产物的转化率。与连续发酵相比，它不会产生菌种老化和变异的问题，适用范围也比连续发酵广。随着研究工作的深入和微机在发酵过程自动控制中的应用，补料分批发酵技术将日益发挥其巨大的优势。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,发酵工艺的控制： 温度：最适温度是既适合菌体的生长，又适合代谢合成的温度。随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变。 pH值：pH值的变化取决于菌种、培养基成分、培养条件 溶解氧浓度，发酵液的需氧量受菌体浓度、基质种类和浓度以及培养条件等因素的影响，其中以菌体浓度最为明显。 放灌时间，根据不同发酵时间所得到的产物产量计算出发酵的生产力和产品成本，采用生产力高而成本又低的时间作为发给时间。要考虑的指标有产物的产量、过滤速度、氨基氮含量、菌丝形态、pH值、发酵液的外观和粘度等，,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,发酵设备,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,下游加工过程： 发酵液预处理和固液分离：预处理的目的是改善发酵液的性质，以利于固液分离（常用酸化、加热、加絮凝剂等方法）。固液分离常用过滤、离心等方法。如目的产物在细胞内，还需要破碎细胞。方法有机械的（如研磨，超声波处理，高压均质法，冷冻解冻交替处理法），生物的（酶处理）和化学的（氢氧化钠、乙酸、草酸、柠檬酸、尿素甲苯、氯仿和甲醇盐酸等） 提取,目的主要是浓缩，也有一定的纯化作用。常用的方法有：1、吸附法2、离子交换法3、沉淀法4、萃取法5、超滤法等 精制：提取中方法也可以用于精制。大分子（蛋白质）依赖于层析分离；小分子物质的精制常利用结晶操作。 成品加工：根据产品要求，进一步浓缩、无菌过滤、去热原、干燥、加稳定剂等步骤。随着膜质量的改进和膜装置性能的改善，膜技术在下游加工过程中使用越来越多。浓缩可采用升膜或降膜式的薄膜蒸发，热敏感性物质，可用离心膜蒸发。对大分子溶液的可用超滤膜浓缩，小分子溶液可用反渗透膜。截断分子量为10，000的超滤膜可以除去分子量在1000以内的产品中的热原同时达到了除菌的目的。干燥方法因物料性质、状态及具体条件可选用真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等方法。,食 品 生 物 技 术 第四章 发酵工程及其在食品工业中应用,固体发酵：是指微生物在无游离水或几乎没有游离水的固体物质上生长发酵的过程。 某些微生物生长需水很少，可以利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产。我国传统的酿酒、制酱及天培（大豆发酵食品）的生产均有一个固体发酵期。固体发酵还可以用于蘑菇的生产、奶酪、泡菜的制作以及动植物废料的堆肥等。固体发酵所用原料一般为经济易得、富含营养的工农业中的副、废品，如麸皮、薯粉、大豆饼粉、高梁、玉米粉等。固体发酵一般都是开放的，无菌要求不高。所需设备简单，操作容易，可因陋就简、因地制宜。但劳动强度大、不便于机械化操作、微生物品质少，生长慢，产品有限等。目前主要的发酵生产多为液体发酵。,食 品 生 物 技 术