不同中药配伍对关木通毒性成分马兜铃酸A含量的影响.doc

不同中药配伍对关木通毒性成分马兜铃酸A含量的影响【摘要】观察比较关木通及龙胆泻肝汤各拆方组中马兜铃酸A的变化趋势，探讨中药配伍对马兜铃酸A含量的影响。【方法】按龙胆泻肝汤原方比例将供试样品分7组：关木通组、全方组、关木通+清热组、关木通+滋阴组、关木通+利水组、关木通+甘草组、阴性对照组（全方去关木通）；采用反相高效液相色谱（RPHPLC）法，以DiamonsilTM(钻石)C18（250mm4.6mm，5m）为色谱柱，以甲醇-水-冰乙酸(体积比74：24：1)为流动相，检测波长315nm，测定各组中马兜铃酸A的含量。【结果】与关木通组相比，龙胆泻肝汤全方中马兜铃酸A含量最低；关木通+滋阴组马兜铃酸A含量也有明显降低。【结论】在方剂配伍理论指导下，通过合理配伍降低关木通的毒性是可行的。【关键词】关木通化学龙胆泻肝汤马兜铃酸A分析中药配伍色谱法高压液相关木通（CaulisAristolochiaeManshuriensis，CAM）为马兜铃植物东北马兜铃AristolochiamanshruiensisKom.的干燥藤茎，其主要化学成分为马兜铃酸A、B、D，马兜铃D甲醚，木兰花碱，齐墩果酸1。关木通苦寒有毒，有清心火、利小便、通经下乳之功效，用于口舌生疮、心烦尿赤、水肿、热淋涩痛、白带、经闭乳少、湿热通痹等。现代研究表明其药理作用有利尿、抗突变、抗肿瘤及降血压的作用2。关木通含有损害人体肾脏的马兜铃酸，2003年6月国家食品药品监督管理局发出通知取消其药用标准，这意味着关木通从此不能作为一种合法中药使用。本文以历代应用最多的名方龙胆泻肝汤（LongdanXieganDecoction，LXD）为例，观察中药配伍是否能降低关木通毒性，从而验证方剂配伍理论的合理性。龙胆泻肝汤出自医方集解，是泻肝胆实火、清下焦湿热的名方。主治肝胆实火上炎，肝胆湿热下注证。近几年来，国内外不断有报道服用龙胆泻肝丸导致肾损害，多与长期超量服用等不合理使用有关3-5。但龙胆泻肝汤应用数百年来却未见有不良反应，本实验采用反相高效液相色谱(RPHPLC)法，观察龙胆泻肝汤及其拆方组对关木通中马兜铃酸A（adritolochicacid，AA)含量的影响，探索中药配伍降低关木通毒性的规律。1仪器与试药1.1仪器戴安SummitP680高效液相色谱仪（美国DIONEX公司）；Chromeleon色谱工作站（美国DIONEX公司）；UVD170U紫外检测器（美国DIONEX公司）。1.2药品对照品马兜铃酸A由国家药品生物制品检验所提供（批号为：110746200406）；龙胆草、黄芩、栀子、泽泻、当归、生地黄、车前子、柴胡、生甘草、玄参、麦冬均购自广州中医药大学第一附属医院中药房，关木通购于河北安国药材市场，经广州中医药大学中药鉴定教研室李薇教授鉴定为AristolochiamanshruiensisKom.。1.3试剂甲醇为色谱纯；冰醋酸、无水甲醇、盐酸、乙醚为分析纯，水为怡宝纯净水。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：DiamonsilTM(钻石)C18（250mm4.6mm，5m）；检测器：UVD170U紫外检测器；检测波长：315nm；柱温：室温（25）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（体积比为75：24：1）；流速1mL/min，进样量5L。2.2样品的制备根据医方集解注：龙胆泻厥阴之热，柴胡平少阳之热，黄芩、栀子清肺与三焦之热以佐之，泽泻泻肾经之湿，木通、车前子泻膀胱之湿以佐之，然皆苦寒下泻之药，故用归、地以养血而补肝，用甘草以缓中而不伤肠胃，为臣使也，将方中龙胆草、柴胡、黄芩、栀子归为清热药，将泽泻、车前子归为利水药，将当归、生地归为滋阴药。剂量按原方比例，分以下7组：关木通组：关木通3g；全方组：关木通3g，龙胆草2g，黄芩3g，栀子3g，泽泻4g，当归1g，生地黄3g，车前子3g，柴胡2g，生甘草2g；关木通+清热组：关木通3g，龙胆草2g，黄芩3g，栀子3g，柴胡2g；关木通+滋阴组：关木通3g，当归1g，生地黄3g；关木通+利水组：关木通3g，泽泻4g，车前子3g；关木通+甘草组：关木通3g，生甘草2g；阴性对照组：龙胆草2g，黄芩3g，栀子3g，泽泻4g，当归1g，生地黄3g，车前子3g，柴胡2g，生甘草2g。取供试样品，加水400mL，浸泡30min，煎煮60min，用纱布过滤。药渣再加水100mL，煎煮30min，纱布过滤。合并2次滤液浓缩至50mL，吸取10mL，用6mol/L盐酸调至pH=2，转移至分液漏斗中，用乙醚萃取4次6（10mL，5mL3）；合并萃取液，水浴蒸干，用甲醇溶解，定容于10mL容量瓶中。通过0.45m的微孔滤膜滤过，即得。2.3对照品溶液的制备精密称取马兜铃酸A对照品适量，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成0.034mg/mL的溶液即得。2.4线性关系考察按照上述色谱条件测定，精密称取马兜铃酸A对照品溶液2.5、5、10、15、20L，以峰面积为横坐标X，以进样量为纵坐标Y，绘制标准曲线，结果马兜铃酸的线性范围0.0840.680g，方程为Y=0.0446X0.0173，R=0.9998（图1）。2.5精密度试验取马兜铃酸A标准品溶液连续进样5次，测得马兜铃酸A峰面积sR为1.8%。2.6稳定性试验取关木通样品在同样条件下，分别于0、2、4、6h进样4次，测定峰面积。马兜铃酸A含量sR为2.6%。结果表明马兜铃酸A在6h内稳定性良好。2.7重复性试验对同1份关木通样品，按样品测定项下同法操作，平行测定3次，计算马兜铃酸A含量，其sR为1.7%。2.8加样回收率实验精密称取已知样品含量的样品5份，分别加入一定量的马兜铃酸A，按2.2项下操作与测定，并根据样品含量及马兜铃酸A对照品加入量，计算回收率。结果平均回收率为99.3%。2.9样品测定取各组样品溶液，在2.1色谱条件下进行测定。结果见表1、图2。表1结果显示，龙胆泻肝汤不同配伍后，关木通中马兜铃酸A含量比较如下：全方组关木通+滋阴组关木通+利水组关木通+清热组关木通组关木通+甘草组。表明全方组中马兜铃酸A含量降低最多。表1龙胆泻肝汤及各拆方组中马兜铃酸A含量比较3讨论龙胆泻肝汤至今已有数百年的应用历史。历代医家在长期的实践中，掌握了关木通配伍的规律。临床运用时在中医药理论的指导下，严格按照龙胆泻肝汤的适应证、用量及注意事项，合理使用，就可以减少或避免其毒副作用的发生7。关木通的肾毒性从中医理论来讲属于利水伤阴，龙胆泻肝汤配伍滋阴药物(生地、当归）以养血而补肝，目的是为了防止渗利的药物伤阴。本实验结果中关木通与滋阴药物配伍可以显著减少马兜铃酸A的含量，与中医配伍理论相符，说明在中医理论指导下，方剂的配伍有合理性。有文献报道8，关木通中毒病例的治疗结果，有1例停用透析后连服中药六味地黄丸加减使病情稳定，肾功能一度恢复正常。张岩等9研究发现，六味地黄丸能显著降低关木通溶液中的马兜铃酸A的含量。六味地黄丸是滋阴补肾的良方，其滋阴养血之功效，可能在一定程度上缓解了关木通的利水伤阴。杨蕾等10初步证明，在导赤散中具有滋阴功用的生地黄对关木通的肾毒性具有一定的抑制作用。从本实验结果可以看出，从中医理论出发，运用方剂配伍规律探求关木通配伍减毒的途径具有一定可行性。关木通与清热药和利水药此类苦寒泻下药相配后，马兜铃酸A的含量没有增加，而是轻度降低，说明它们对机体的影响并不大，可能是针对病症而起作用。中药甘草有解百毒作用，但配伍甘草后，马兜铃酸A的含量反而增加，可能与这两味药性存在七情相反有关。甘草缓解关木通毒性可能在体内作用机制上，而不是在降低马兜铃酸A成分上。甘草酸是甘草最主要的活性成分，研究表明甘草酸对马兜铃酸A致肾小管损害有积极的保护作用11。要明确甘草对关木通毒性的影响，还有待进一步研究。关木通的毒性可以通过配伍而降低，充分体现了方剂的配伍特色。但其与甘草配伍后毒性反而增强，提示在注意方剂配伍减毒的时侯，也要留意配伍增毒的可能，而且不能仅局限于十八反、十九畏的理论。在中医理论指导下，探索方剂配伍降低有毒中药的毒性，对于研究中药安全性，扩大此类中药的临床运用，促进中医药走向现代化有着重要意义。【参考文献】1高学敏中药学（上册）M北京：人民卫生出版社，2000：7692王瑛，潘竞先，高建军，等.中药关木通中的抗肿瘤成分研究J.北京医科大学学报，2000，32（1）：18.3陶靖环.龙胆泻肝汤致严重肾功能损害J药物流行病学杂志，2004，l3（6）：351.4李庆，杨素珍.龙胆泻肝丸致慢性肾衰竭病例报告J.中国中西医结合急救杂志，2003，10（6）：383.5王会玲，张金元，杜兰屏，等马兜铃酸肾病44例临床分析J.上海中医药杂志，2006，40（）：13.6刘燕，王宝琴.马兜铃中马兜铃酸A的HPLC测定J.中草药，1990，21(6):15.7焦一鸣，王放.谈龙胆泻肝丸的合理应用J.实用中西医结合临床，2005，5（3）：86.8马红梅，张伯礼.关木通肾毒害