2 O2 处理大块牛松质骨后成分分析.doc

2O2处理大块牛松质骨后成分分析作者：罗卓荆胡蕴玉刘智广【关键词】骨移植关键词:骨移植；氨基酸分析；移植，异种摘要:目的研究大块牛松质骨（MBCB）处理后的各种成分及高浓度H2O2消除异种骨抗原性的机制.方法采用干燥失重法及残渣法检测经过系统去抗原处理后的大块异种骨的有机、无机质及水份含量；将25块大块新鲜牛松质骨均分为5组，分别用高浓度H2O2浸泡0，24，48，72和96h，采用氨基酸分析方法研究不同H2O2处理时间的骨块中羟脯氨酸、脯氨酸含量.结果经处理后，MBCB为色白，并呈现出多孔样结构，扫描电镜观察，松质骨呈清晰的多孔结构，孔壁光滑；5组检测样品中羟脯氨酸及脯氨酸的含量随着H2O2处理时间的延长均有同步下降的趋势，但各组间无显著性差异（P>；0.05）；5组检测样品中18种氨基酸含量及氨基酸总量随着H2O2处理时间的延长亦有同步下降的趋势，仅0h与96h组间18种氨基酸以及总氨基酸含量有显著性差异（P<；0.05），其余各组间无显著性差异（P>；0.05）；5组检测样品中羟脯氨酸及脯氨酸在总氨基酸总量所占比例随着H2O2处理时间的延长无明显变化，各组间无显著性差异（P>；0.05）.结论大块异种骨经系统去抗原处理后，保持了一定的有机及无机质比例，既具有良好的力学特性又消除了其抗原性，提示高氧化剂引起蛋白质变性是消除大块异种骨抗原性的主要原因.Keywords:bonetransplantation；aminoacidanalysis；com-ponent，heterologousAbstract:AIMToanalysethecomponentsofantigen-elimi-natedmassivebovinecancellousbone（MBCB）andtostudythemechanismofhighconcnH2O2eliminatingtheantigenici-tyofxenogenicbone.METHODSDry-weightlostmethodwasappliedtomeasuretheorganic，mineral，andwatercom-ponentsinMBCB；25massivefleshbovinecancellousboneblocksweredistributedinto5groups，whichweredippedin300mL・；L-1concnH2O2for0，24，48，72，96h.Thequan-titiesofhydroxyprolineandprolineinthefivegroupsweremeasuredbyaminoacidanalysis.RESULTSAftertheanti-geneliminatingprogram，MBCBoccurredaswhitecolourandporousstructure.SEMshowedthewallofbonetrabeculainthecenterpartofMBCBwasquiteclear.ThequantitiesofhydroxyprolineandprolinedecreasedalittlewiththetimetreatedinhighconcnH2O2inthefivegroups，butnodiffer-encesbetweenthefivegroupswerefound；thesamedecreas-ingtendencywasfoundtothequantitiesof18aminoacidsoftheboneblocksinthefivegroups；differencewasonlyfoundbetween0hand96hgroup（P<；0.05）.Thepercentofhy-droxyprolineandprolineinaminoacidswasnotfoundanydifferenceinthefivegroups（P>；0.05）.CONCLUSIONTheMBCBmaycontainreasonablerateoforganicandminer-almaterial，whichisbeneficialtokeepingthemechanicprop-ertyofMBCBafteritsantigen-eliminatingprogram.Denatu-ralizationofproteinintheconditionofoxidationofhighcon-cnH2O2wouldbethemajormechanismtoeliminatetheanti-genicityofmassivexenogenicbone.0引言在以往颗粒型异种松质骨处理与应用的基础上1，为了更广泛地应用大块异种骨修复四肢大节段骨缺损，我们对高浓度H2O2去抗原处理异种骨的机制进行研究，同时对异种骨经去抗原处理后的成分进行分析，为异种骨块的临床应用提供实验基础.1材料和方法1.1材料新鲜牛肱骨上端松质骨.1.2方法大块去抗原牛松质骨（antigen-extractedmassivebovinecancellousbone，MBCB）选取新鲜牛肱骨上端松质骨，截取15mm20mm30mm形状规则长方体骨块，用50压力水反复冲洗，沥干；50下11氯仿甲醇脱脂24h；50下300mL・；L-1H2O2浸泡24h；重复步骤2次，脱脂共24h3，H2O2处理24h3；双蒸水透析12h2；0.3mol・；L-1的HCl内脱钙处理5min，双蒸水反复冲洗至pH6.0；冷冻干燥，密封包装.1.2.1MBCB的扫描电镜SEM观察4mm大小的电镜样品分别取材于新鲜牛松质骨及MBCB，多聚甲醛固定，锇酸及乙晴处理，真空镀膜，扫描电镜观察.1.2.2MBCB的成分检测参照中华人民共和国药典1995版，干燥失重法及残渣法.检测步骤:取相同小坩锅4个，置80烘烤24h，蒸发坩锅内水分；选取密封的MBCB冻干骨4块，编号A，B，C，D，分别准确称质量（m），再分别放入坩锅内称质量（m1）；将MBCB及坩锅同置于110烘烤24h，干燥塔内凉至室温后称质量（m2）；将块型牛松质骨载体及坩锅再置于马佛电阻炉内，800灼炽7h，干燥塔内凉至室温后准确称质量（m3）；计算方法含水量mwater=m1-m2，含有机质morganic=m2-m3，含无机质mmineral=m3-（m1-m）.1.2.3MBCB的氨基酸分析将25块新鲜牛肱骨松质骨块经水洗、脱脂后分为5组，各组5枚骨块，分别置于50300mL・；L-1H2O2溶液中0，24，48，72和96h进行浸泡处理，将处理后的异种骨块进行氨基酸检测分析.将上述各组样品均置于80下烘干24h，在干燥室内冷却至室温后准确称取20mg，放于消化管中；加入6mol・；L-1HCl共3mL，立即旋紧管盖，置110下酸水解22h；将酸水解液倒入蝶型坩锅内，于100水浴挥发盐酸，再加入少量蒸溜水，蒸干共3次；用适量pH2.2柠檬酸钠缓冲液溶解，使其终浓度为干骨样品20g・；L-1；12589g离心15min，取上清液备用，做羟脯氨酸、脯氨酸及氨基酸总量定量分析.羟脯氨酸、脯氨酸测定:Beckman121MB型氨基酸分析仪，分析程序为自编胶原特异性氨基酸分析程序2；填充树脂为BeckmanAA10型，柱床10cm，pH2.20，配制pH3.0柠檬酸钠缓冲液和茚三酮试剂3，600mol・；L-1羟脯氨酸、脯氨酸标准液（上海华美生物工程公司）用pH2.20缓冲液配制；柱温46恒温；上样量50L；缓冲液流速10mL・；h-1，茚三酮流速5mL・；h-1；检测波长440nm，数据处理系统为HP-3394A积分仪.骨样品中羟脯氨酸、脯氨酸含量用下式计算1，4Cs=S样品氨基酸标准液浓度样品稀释倍数氨基酸分子质量S标准1000Cs干骨羟脯氨酸或脯氨酸含量（mg・；g样品标准液中羟脯氨酸或脯氨酸波峰面积；S标准样品液中羟脯氨酸或脯氨酸波峰面积.采用方差分析方法处理实验数据，比较H2O2不同浸泡处理时间的各组中羟脯氨酸、脯氨酸含量.氨基酸总量的测定:紫外/可见光分光光度计（BeckmanDU-60），氨基酸标准液（Beckman公司，内含18种氨基酸，每种氨基酸浓度为100mol・；L-1，氨基酸终浓度1800mol・；L-1），分别准确吸取各组骨水解液10L、氨基酸标准液20L、空白对照之双蒸水20L，用双蒸水补足定容至2mL，加入茚三酮试剂2mL，置100水浴5min，流水冷却至室温，测吸光度，检测波长为570nm.在波长570nm条件下，骨样品中羟脯氨酸及脯氨酸吸光度极低，故骨样品中总氨基酸含量Cs总由18种氨基酸含量Cs18加上由440nm检测的羟脯氨酸Cs羟脯及脯氨酸Cs脯含量组成.Cs18用以下公式计算Cs18=A样品18种氨基酸标准液浓度稀释倍数18种氨基酸平均分子质量A标准Cs18骨样品中18种氨基酸含量（mg・；g-1）；A样品样品液中吸光度；A标准标准液中吸光度.氨基酸总量Cs总=Cs18+Cs羟脯+Cs脯2结果2.1MBCB的大体及SEM观察MBCB经系列化学处理后，色白，并呈现出多孔样结构，具有一定的韧性及坚硬度.新鲜牛松质骨扫描电镜观察，未显示出多孔隙结构，孔隙被骨髓及油脂等充满；MBCB扫描电镜观察，松质骨呈清晰的多孔结构，孔壁光滑（Fig1（略）.2.2MBCB成分检测结果MBCB中水分、无机质、有机质质量分数见Tab1.w（水）=m水m=65.61392.0100%=4.7%；w（有机质）=m有m=666.71392.0100%=47.9%；w（无机质）=m无m=659.71392.0100%=47.4%.表1MBCB中水分、无机质、有机质质量分数（略）2.3H2O2处理异种骨的氨基酸分析5组检测样品中羟脯氨酸及脯氨酸的含量随着H2O2处理时间延长均有同步下降的趋势，但变化程度并不明显，各组间无显著性差异（P>；0.05，Tab2）.骨样品中18种氨基酸及总氨基酸含量随着H2O2处理时间的延长均有同步下降趋势，但变化并不明显，仅0h与96h组间18种氨基酸以及总氨基酸含量有显著性差异（P<；0.05，Tab3），其余各组间无显著性差异（P>；0.05）.5组检测样品中羟脯氨酸及脯氨酸在总氨基酸总量中所占比例随着H2O2处理时间的延长无明显变化，各组间无显著性差异（P>；0.05，Tab4）.表2骨样品中羟脯氨酸、脯氨酸质量分数（略）表3骨样品中氨基酸质量分数表4氨基酸中羟脯氨酸、脯氨酸质量分数（略）3讨论松质骨由骨小梁及骨小梁间的骨髓成分构成，骨髓内包含大量的各种血细胞以及血管、神经、脂肪等组织，骨髓将骨小梁间隙填充，在扫描电镜下未能见到松质骨的多孔样结构.异种骨抗原分布研究资料表明，骨中的主要抗原成分集中于骨细胞、成骨细胞、软骨细胞以及骨髓细胞、血浆等5.在本实验中，反复采用50压力水冲洗，使松质骨中细胞低渗裂解，氯仿甲醇脱脂清除骨小梁间的大量脂肪组织，以高浓度H2O2浸泡处理，二者交替进行，结合离心处理，将牛松质骨内的脂肪、细胞及残片均有效清除.处理后的牛松质骨在SEM观察下显示清晰的多孔结构，孔壁干净、光滑，未见其他物质残留，彻底清除异种骨中的主要抗原物质，为骨生长因子的复合及新骨的长入提供理想的微环境4.正常成熟骨中含水质量分数为20%25%、有机质40%和无机盐60%，无机盐决定骨的强度，而有机质决定骨的弹性和韧性.本实验中冻干MBCB的成分检测结果表明，MBCB的水分残留质量分数低于5%，而胶原等有机质和无机骨矿各占47%左右，由于保持了合理的有机及无机质比例，故也保持MBCB一定的韧性和强度6.成熟骨的有机质中大约90%为胶原，其余为氨基多糖、其他蛋白质、肽类及脂类.骨基质中的胶原主要是型胶原，由两条1肽链和一条2肽链相互拧成的三联螺旋结构.肽链组成有以下两个主要特点肽链的氨基酸排列顺序中，每隔两个其他氨基酸残基就有一个甘氨酸；肽链中含有其他蛋白质中含量极少的羟脯氨酸与羟赖氨酸，脯氨酸及赖氨酸的含量也较多，羟脯氨酸与脯氨酸残基是维持原胶原分子三联螺旋构型的重要组成部分.在型胶原肽链的1000个氨基酸残基中，甘氨酸约占330个，脯氨酸约占129个，羟脯氨酸约占96个，赖氨酸约占30个，羟赖氨酸约占4个.不同组织中的胶原所含羟脯氨酸及羟赖氨酸残基差很大，因此，检测骨基质中羟脯氨酸及脯氨酸含量，可特异地反应骨基质有机质中包括胶原蛋白在内的各种组成成分的变化.以往认为，高浓度H2O2处理异种骨，其消除抗原性的原理在于清除骨基质中抗原性较强的蛋白成分，即脱蛋白过程.我们发现，骨基质中的氨基酸总量随着H2O2处理的时间延长并无明显的降低，而羟脯氨酸及脯氨酸在氨基酸总量中所占比例也未发生明显改变，没有表现出大量去除蛋白的现象.回顾以往的研究结果，牛松质骨在H2O2浸渍时间越长，骨块机械强度损失越严重6，以及H2O2处理时间越长，异种骨抗原性消除越彻底7，分析H2O2消除异种骨抗原性的机制可能在于强氧化