SPE和HPLC对微生物降解体系中十溴联苯醚含量的测定.doc

SPE和HPLC对微生物降解体系中十溴联苯醚含量的测定 赵银平，赵晓祥，王玥 （东华大学环境科学与工程学院，上海） 摘要：采用固相萃取法提取菌降解体系中的十溴联苯醚（），高效液相色谱法测定十溴联苯醚的含量，并对各种试验条件进行了优化。结果表明，固相萃取的最佳洗脱剂为正己烷二氯甲烷（，），最佳洗脱体积为（）；高效液相色谱法的最佳检测条件：检测波长为，柱温箱温度为，流动相为乙腈水（，），流动相流速为，在此条件下的出峰时间为；菌在内能够快速降解高浓度（），第天的降解率达到最高为。通过固相萃取法和高效液相色谱法能够快速提取和检测微生物降解体系中的十溴联苯醚，该方法操作简单，节省时间。 关键词：十溴联苯醚（）；固相萃取法（spe）；高效液相色谱法（hplc）；菌；降解率 ：A：0439114（15）051198-05 DOI：10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.05.043 ： 基金项目：上海市基础研究重点项目（） 作者简介：赵银平（），女，河南林州人，在读硕士研究生，研究方向为环境微生物学，（电话）（电子信箱）； 通信作者，赵晓祥，研究员，硕士生导师，主要从事有机污染物的降解、监测与分析等相关研究,（电子信箱）。 多溴联苯醚（）是一类高效添加型溴系阻燃剂，被广泛应用于各种电子、电器、纺织、建材等产品中，。而这些产品在大量生产、使用和废弃的过程中，均不同程度地使进入各种环境介质当中，甚至在人的毛发和母乳中都能检测到。据研究表明，具有致癌性及内分泌干扰毒性，因此环境中的严重威胁人类健康及生态安全。 多溴联苯醚中的十溴联苯醚（）因其具有溴化程度高，阻燃性能好，价格低等优点，所以是使用最多的一种，。目前，环境样品和生物样品中的提取方法主要有索氏提取、液液萃取、超声波辅助萃取和固相萃取（）等方法。相比于其他方法，固相萃取具有耗时短、消耗溶剂少、操作简便等优点，可以高效提取样品中的。的检测方法主要有高效液相色谱法（）和气相色谱质谱联用法（），其中的离子源多采用源，而采用源的不能检测高溴代联苯醚，例如。 本研究采用微生物法对进行降解，并采用固相萃取法（固相萃取小柱）和法对降解体系中的进行提取和检测。试验过程中对的检测条件进行了优化，同时考察了不同溶剂对的萃取效率，为水相中高浓度的提取和检测提供一定的理论依据及基础。 材料与方法 试验材料 试剂二甲亚砜（级），二氯甲烷（级），正己烷（级），四氢呋喃（级），甲醇（级），乙腈（级），均购自上海凌峰化学试剂有限公司；（纯度，百灵威科技有限公司）。储备液：以二甲亚砜为溶剂配成浓度为的储备液。标准溶液：以二甲亚砜为溶剂将储备液稀释成浓度为的标准溶液。将无水硫酸钠置于马弗炉中于下烘以上，稍冷后放入干燥器中冷却，密封保存，备用。 培养基液体培养基：鱼粉蛋白胨、酵母粉、氯化钠、去离子水，。固体培养基：向液体培养基中加入的琼脂即可。无机盐培养基（）：、微量元素；去离子水，。其中微量元素溶液组成为：、（）、去离子水。 菌株试验中所用的长野雷夫松氏菌（，简称菌）系赵晓祥课题组筛选获得的能够降解高浓度的纯菌，其最佳生长条件为，摇床转速。 加标样品以浓度为的无机盐培养基作为固相萃取的加标样品，无机盐培养基中接入灭活的菌。 仪器型高效液相色谱仪（日本岛津公司），配色谱柱（，日本岛津公司）；型固相萃取仪（上海科学仪器有限公司），固相萃取小柱柱（，上海科学仪器有限公司）；-型隔水式电热恒温培养箱（上海博泰实验设备有限公司）；型立式双层摇床（上海世平仪器设备有限公司）；型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。 试验方法 菌种的活化及菌悬液的制备取环保藏于甘油中的菌并直接在固体培养基上划线培养，然后挑取单菌落再一次划线培养，一共活化次。最后挑取单菌落于培养基中培养，此时菌处于对数期，然后取适量菌液于离心，收集菌体并用生理盐水洗涤菌体次，以等体积的生理盐水重悬，即得菌悬液。 高效液相色谱条件优化采用法对（以四氢呋喃为溶剂）的检测条件进行优化，手动进样，进样量为。检测波长的选择。通过对进行紫外扫描，确定的检测波长；流动相比例及流速的选择。依次选用甲醇去离子水、乙腈去离子水为流动相，比较两种洗脱剂在不同配比的情况下的色谱行为；选择好流动相后，改变流速以确定的出峰时间。 固相萃取条件优化洗脱剂种类的选择。介于非极性和极性之间，根据相似相溶原理，选择从非极性到极性种不同的洗脱剂，即正己烷、正己烷二氯甲烷（，）、正己烷二氯甲烷（，）、正己烷二氯甲烷（，）、二氯甲烷。的固相萃取过程为：先用二氯甲烷预洗固相萃取小柱，于负压下抽干溶剂，再依次用甲醇和去离子水活化，活化过程要保持小柱床体材料湿润；然后将加标样品进行上样，之后用去离子水淋洗以去除吸附在床体的杂质，并于负压下抽真空，直至小柱床体材料完全干燥；最后采用、（共）不同极性的洗脱剂依次对目标化合物进行洗脱，收集洗脱液。最终洗脱液过无水硫酸钠去除水，经有机滤膜过滤后进样检测。每种洗脱剂进行次平行试验，重复次。洗脱剂体积的选择。分别用、正己烷二氯甲烷（，）对进行次洗脱，并分别收集洗脱液，依次编号，分别计算各洗脱液的绝对回收率及洗脱率。进行次平行试验。 菌对的降解于锥形瓶中加入标准储备液，使得体系中的浓度为。待二甲亚砜挥发后，加入无机盐培养基，下高压灭菌。待培养基冷却到室温，接入菌悬液，接种量为。、摇床避光降解培养，每天各取样1次，每次取样，用二氯甲烷正己烷（，）对培养基中残余的进行洗脱，合并洗脱液后立即进行检测。以接入灭活的菌悬液的无机盐培养基为空白对照，每一处理设个平行，重复次。 结果与分析 高效液相色谱条件优化 检测波长的选择的紫外扫描光谱曲线如图所示。从图中可以看出，在内，对紫外光都有较好的吸收。据研究，的的检测波长多选择和，本研究最终确定其检测波长为。 柱温的选择色谱柱的温度直接影响样品的分离效果，由于的紫外吸收较强，且较易洗脱，所以对温度的要求不太苛刻，因此本研究控制色谱柱的温度为。 流动相的选择当采用以乙腈水（，）为流动相，流速为时，在出现明显的色谱峰，但保留时间较长。增加有机相比例，即乙腈水（，），流速为时，的出峰时间提前到0。在相同流速下，流动相改为甲醇水（）时，出峰时间延迟到。继续增加有机相比例，即乙腈水（，）为，流速保持为时，的出峰时间提前到0，但是峰的前段发生倾斜，且整个峰型不对称。当有机相比例保持在乙腈：水（，）流速提高到时，的出峰时间提前到，而且峰型没有发生变化。试验结果表明，与甲醇水体系相比，采用乙腈水体系作为流动相，可以缩短的出峰时间；流速从升高到，不仅可以缩短出峰时间，而且还可以保证色谱峰的峰型。本研究最终选择乙腈水（，）体系作为流动相，且乙腈水流速为，可以保证样品中的各成分有效分离，且色谱峰的峰型也较好，的保留时间为，的色谱图如图所示。 标准曲线 采用外标法定量。准确量取一定量的标准溶液，用二甲基亚砜配制成浓度为、的溶液。采用法分别测定各个浓度的溶液，将测得的各浓度溶液相对应的峰面积（）随浓度（）作图，建立校准曲线，如图所示。从图中可以看出，在内线性关系良好，R2为。标准曲线方程为。 固相萃取条件优化 洗脱剂种类的选择经过正己烷、正己烷二氯甲烷（，）、正己烷二氯甲烷（，）、正己烷二氯甲烷（，）、二氯甲烷这种不同极性的洗脱剂对进行洗脱，其洗脱效果见表，从表中可看出，正己烷对的洗脱效果最差，而其余种洗脱剂均能较好地洗脱，其中正己烷二氯甲烷（，）对的洗脱其回收率为，基本能够完全洗脱，选择正己烷二氯甲烷（，）作为的洗脱剂。 洗脱剂体积的选择依次用、正己烷二氯甲烷（，）对吸附在固相萃取柱中的进行洗脱，其洗脱效果见图。由图可见，目标化合物主要随第一个洗脱液流出，的被洗脱掉，而洗脱液中仅含有微量的，洗脱液中已无目标化合物的流出。因此体积为的洗脱液已能将全部洗脱。 菌对的降解 经过d的降解，在上述优化后的条件和固相萃取条件下，对微生物体系中的残留量进行测定，结果见图。从图中可看出试验的前培养液中的被菌快速降解消耗；第天培养液中的浓度为，降解率比较低，这主要是因为第天微生物处在一个适应环境的状态；第天和第天培养液中的浓度迅速降低，并且在第天时培养液中的浓度最低，为，此时的降解率达到最高，为；第天和第天，培养液中的的浓度略微有些升高，可能是部分菌死亡使得体内未被分解的释放到培养液中导致的。因此，采用法和固相萃取法，能够高效检测微生物体系中的含量，同时可知菌在内能够快速降解。 小结与讨论 高效液相色谱条件优化结果 的高效液相色谱检测条件为：根据的紫外扫描光谱曲线，确定的检测波长为；的紫外吸收较强，并且比较容易从色谱柱上洗脱下来，因此温度对的检测影响不大，选择作为的检测温度；流动相种类、比例和流速均能影响的出峰时间和峰形，当流动相为乙腈水（，）以及流速为时，不仅能够提前出峰，而且峰形也比较好，其出峰时间为。 固相萃取条件优化结果 是一种介于中等极性的有机物，因此与极性相似的洗脱剂能够完全将其从固相萃取柱中洗脱出来，的最佳洗脱剂为正己烷二氯甲烷（，），最佳洗脱体积为（），洗脱回收率为，为。 菌对的降解效果 菌是一种能够有效降解高浓度的微生物，经过d的培养，被菌降解。采用固相萃取和高效液相色谱法对该降解体系中的进行提取和检测，第天降解体系中的残留浓度最低，降解率为；第天和第天菌部分死亡使得菌体内未被分解的释放到培养液中，导致体系中的浓度略有上升。通过固相萃取和高效液相色谱法能够快速提取和检测微生物降解体系中的含量，对水相中的检测提供一些实践基础和理论意义。 参考文献： 刘汉霞，张庆华，江桂斌多溴联苯醚及其环境问题化学进展，（）： ，：（）（）：，（）： 董洪梅，魏东洋，万大娟，等多溴联苯醚的环境行为及其降解研究进展安徽农业科学，（17）：，9429. ，l，（）： ，（）USa，（）： ，（）： 李英明，王亚韦华，江桂斌新型持久性有机污染物概述实验与分析，（）： ，：，（）： ，of，（）： ，（）： 任金亮，王平多溴联苯醚环境行为的特征与研究进展化学进展，（）： ，（）： 薛铮然，李海静高效溴系阻燃剂十溴联苯醚生产工艺研究山东化工，（）：