染色体标本的制作及组型观察.doc

山东大学实验报告 2014/12/2姓名：XX 系年级：20XX级齐鲁医学班 学号：20130023XXXX科目: 细胞生物学实验 实验题目: 动物染色体标本的制备与观察 染色体标本的制备及组型观察【实验目的】1. 掌握染色体标本制作的基本方法；2. 认识不同生物的染色体的状态，学会做染色体组型图。【制作染色体标本的意义】了解染色体的特征（形态、大小、数目）绘制染色体组型图【染色体组型图的应用】 生物学方面：根据染色体特征鉴别生物及种类：兔44条；小鼠40条；大鼠42条；鸡78条；猫38条；狗78条；人46条；马64条 临床医学方面：主要用于遗传性疾病的诊断和研究：21三体综合症：是21对常染色体多一条，此种人“先天愚型”，或称“伸舌样白痴”卵巢退化症：45 XO，外貌表现为女性，卵巢发育不全或无，1.5米以下，不能生育。睾丸退化症：47 XXY ，外貌为男性，比一般男性高，睾丸发育不全，有女性样乳房，智力低下或超常，不能生育，发声尖高。因此，染色组型实验广泛应用于胎儿遗传性疾病早期诊断中（抽羊水做组型）【染色体标本制作的原理】细胞具有旺盛的分裂能力 选择活跃的组织：胸腺，骨髓，睾丸，小肠制作染色体标本的先决条件 施加药物使细胞分裂：PHA 设法得到大量的分裂中期细胞：秋水仙素1. PHA：促进细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变成淋巴母细胞。2. 秋水仙素：破坏微管装配，使纺锤体不能形成，使大量细胞停在分裂中期。3. 空气干燥：使细胞与染色体展开。4. 低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体间的距离变大，易于染色体分散开。5. 固定：用Camoys solution,作用使蛋白变性，对染色体内的组蛋白讲，变形后硬度增加，保持了染色体的“即时形态”对细胞膜蛋白讲，变性使细胞膜硬度增强，形成屏障作用，防止了细胞内物质外溢和丢失。【实验用品】1. 实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、离心管、离心机、小烧杯、冰箱、酒精灯、小烧杯2. 实验药品：蒸馏水、0.9% NaCl溶液、0.3% KCl溶液，固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、秋水仙素3. 实验材料：小鼠【实验步骤】1. 取雄性小鼠，以每克体重4微克注射秋水仙素（约1mL），14-16h后，用断头法处死小鼠，取出睾丸用生理盐水（0.9% NaCl溶液）洗去血污，置于解剖盘中。2. 将睾丸放入装有1mL 0.3% KCl溶液的小烧杯中剪碎（液体呈乳白色）。3. 用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3% KCl溶液至4mL。4. 37静置30mins，进行低渗处理。5. 以800-1000r/min离心8分钟。6. 弃上清液，加入2mL甲醇冰醋酸固定液。用吸管至管底吹气，轻轻打散细胞，固定8mins。7. 再以800-1000r/min离心8分钟。8. 弃上清液，加入1mL甲醇冰醋酸固定液，再制成细胞悬液，固定5mins。9. 取去洁净的低温预冷载片，距载片10-15cm的高度滴下2-3滴细胞悬液，从载片一边向另一边轻轻吹气，并同时轻轻敲打载片，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。10. 用滤纸擦去载片上的多余液体，空气干燥或文火干燥。11. 用染液染色2030分钟，细水冲洗玻片背面，去除多余染液，气干。12. 镜检：低倍镜下寻找分散良好，染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察染色体形态并计数。【实验结果】精子头部 精子鞭毛 分裂中期的染色体 未破碎的细胞 分裂中期染色体【实验结果分析】1. 显微镜下可看到蓝紫色的染色体。还有很多未破碎的细胞。因为本实验采用的是小鼠的睾丸进行实验，所以视野中可见大量的精子，它们有一个比较圆的头部和鞭毛。2. 我观察到的细胞处在分裂中期，显微镜下大致可观察到32条染色体，这可能是因为部分染色体在实验过程中丢失；分析丢失原因如下：（1）. 摔碎细胞时可能高度有点过高，导致细胞被摔碎后，其中的染色体也被一同摔了出去。（2）. 因为染色时间过长，玻片在染液中浸泡时间太久，染色体丢失在染液中。3. 有同学在显微镜下观察到20条染色体，这部分细胞为单倍体细胞，处于减数第二次分裂中期。4. 实验结果所得到的染色体大多数棒状而不是V型，这是因为吹气时染色体未展平好。5. 实验中观察到的大多数细胞未破碎，分析原因可能如下：（1）. 摔细胞时高度不够，细胞未完全摔碎； （2）. 在剪碎组织时没有剪好，大量细胞聚集在一起，滴片时采用的高度很难摔碎； （3）. 低渗不完全，细胞膨胀不完全，很难摔碎； （4）. 敲打细胞时力度不够，导致细胞还是聚集在一起。【注意事项】1. 吹散细胞：应该轻轻地吹细胞，如果太用力会导致细胞破裂。2. 铜网过滤：利用铜网进行过滤操作的时候，应尽量将组织剪碎，并且让滤液慢慢流下，不能人为破坏铜网以加快速度。3. 剪碎组织时，应尽量将组织剪碎，若烧杯中或者过滤完铜网上还有较大块的组织，应在烧杯中继续加入0.3% KCl溶液，继续剪。4. 本实验采用倒置染色法，目的：1）. 可以节省染料；2）.可以避免染液快速挥发；3）.可以防止染色颗粒沉淀，影响观察。5. 在染色时应注意，多个样品同时染色应摆放紧密，不要有间隙；滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。6. 染色：染色之后应冲去染液并晾干，注意使用小水流并从背面冲洗，这样可以避免冲去细胞。7. 摔碎细胞：摔碎细胞时应注意滴管与载玻片的距离，如果距离太小，则细胞很难摔碎，不会观察到染色体；但如果距离太大，会使细胞完全的碎开，染色体飞出或者染色体布满视野，给计数造成一定难度。【实验反思】本次