真菌检测方法.doc

。分离培养：无菌采取病料接种马铃薯琼脂培养基中，置37恒温箱中培养24小时，长成绒毛样菌丝，未见其它细菌生长。经48小时培养长成白色菌落。72小时菌落呈纽扣状，由中心向外周逐渐变深，转变成灰白色、灰绿色。取培养物镜检可见大量球形的分生孢子。通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部真菌，包括皮肤癣菌、孢子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌等。而霉菌多为细胞真菌的一种，也为深部感染真菌，包括烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌等，常发生于免疫力低下的患者，引起全身播散性感然，影响预后。培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO),其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长,而CAO则适合于高渗性霉菌生长,酵母菌几乎不长。在日常检测中我们发现,有些常见的耐高渗性霉菌,如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长,而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方:蔗糖400g,麦芽提取汁20g,酵母提取汁5g,琼脂20g,氯霉素50mg,蒸馏水1000ml;DG18琼脂配方:葡萄糖10g,蛋白胨5g,KH2PO41g,MgSO47H2O 0.5g,氯霉素0.1g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH6.5)上则正常生长,孢子、形态特征发育良好,而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长,因此,若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌,将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等,更有必要同时采用M40Y或DG18。由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素,危害较小,而有的菌株即使污染数量不多,但其产生的霉菌毒素却危害较大,因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度,重要的是要知道污染菌的菌相,才能更好地判断被污染食品的安全程度。为此,国外有些研究者设计出各类选择性培养基,可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方:酵母提取汁20g,蛋白胨10g,柠檬酸铁铵0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30培养23天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落,非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此,针对不同样品,有目的地设计出相应的选择性培养基,以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。2接种方式接种方式主要有倾注法和涂布法两种。目前国际方法中采用倾注法,但近来国际上有不少学者认为霉菌计数采用涂布法更合适。Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了大量比较试验后发现,对霉菌计数来说,涂抹法有以下几方面优越于倾注法:培养出的霉菌菌落数较多;培养所需的时间较短;霉菌孢子、菌落形态特征发育完全,便于鉴定。这是因为绝大多数霉菌是好氧的,在培养基表面生长快,发育好,而混在培养基中发育就受影响,而且在培养基倾注时霉菌孢子易受热损伤。我们在自己的实验室也做了类似的比较试验,通过对30种常见霉菌的试验证实了上述的结论。因此,我们认为,霉菌计数采用涂布法既准确又省时,值得推广。3培养温度经对多种常见霉菌的最适生长温度作了调查发现,大部分菌种的最适温度为2530。但一些产曲霉毒素的菌株或动物致病菌则需要更高的温度,如黄曲霉35、构巢曲霉33、烟曲霉37、小孢子菌35。因此,培养温度也应根据培养目的而定,一般情况下都采用2528培养,若有特殊培养目的,则应适当调节培养温度。4培养时间我们对30种常见霉菌的生长速度作了调查,正常培养条件下,培养34天的菌落数与57天的基本相同,但菌种的特征不明显,因此,如果只要作霉菌计数,培养34天已基本达到目的,但如果还要进一步分类鉴定,则需要培养更长的时间(714天)。必须特别注意的是,有几类生长特别快、菌丝很多的菌,则必需在48小时以内计数,否则菌丝就会覆盖整个平皿,无法准确计数。这类菌主要有:毛霉、根霉、犁头霉、共头霉、木霉等湿度较大的样品,这类菌污染较多,检测这类样品,应提早观察记录。5最适计数范围霉菌菌落由孢子和菌丝组成,相当扩散,在直径9cm的平皿里,菌落数稍多就相互交叉重叠,影响计数,但数量太少又会产生较大的误差,因此选择适当的稀释度计数是保证结果准确的关键环节之一。我们对这方面作了一些观察研究,首先是将实验菌株的斜面培养物制成含有约106个/ml的孢子悬液,并用血球计数器在显微镜下准确计数,然后将饱子悬液作10-110-6倍稀释,吸取不同稀释度的稀释液接种于PDA,25培养5天后计数。30种常见霉菌的两种不同计数方法所得结果比较显示,大部分菌株每平板含有1050个菌落的稀释度时的计数与显微镜计数结果最接近;有近一半的菌株,每个平板含50100个菌落已较难计数,而大部分菌株,超过100个/平皿或小于10个/平皿的计数结果就与显微计数结果存在较大差别,因此,应尽量选择1050个/平皿的稀释度进行霉菌计数。而对上述提及的菌丝很丰富、菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株,则应在更少的范围内计数(30个/平皿以内)。为控制霉菌的生长速度和菌落的生长范围,可在培养基中添加少量抗生素,如氯霉素(50100mg/L),金霉素(20100mg/L),庆大霉素(50mg/L),土霉素(100mg/L)等。6霉菌检测过程中应特别注意的事项6.1由于霉菌检测所需的时间较长,中间又需要多次观察,因此实验前一定要作好实验计划,明确观察记录的时间。6.2霉菌孢子通过空气传播,所以实验时应保持实验室平静,减少空气流通;操作时手脚要快,动作要轻,特别是培养过程中,如果观察时动作过大,早期生长出的霉菌孢子就会在培养基内扩散,形成新的菌落,导致结果不准确。6.3实验前应认真做好全面的消毒工作,包括操作人员手指、实验室空间、实验台等,实验后应第一时间将有霉菌的培养物高压灭菌,防止进一步扩散。6.4对使用的菌株的生理、生态、形态、毒理、致病性必需有充分的了解,并作好相应的防扩措施,防止污染其它物品。3.2.1 涂片镜检分别取l5 羽鸡肺部或气囊有结节的病料，将结节用2 片载玻片压碎后分开，再用镊子调匀，革兰氏染色后盖上盖玻片，置高倍镜下观察。结果在暗视野下可见到大量的分隔菌丝， 气囊上的结节除可见到菌丝外， 还可以见到散在的蓝色球状孢子。3.2.2 分离培养挑取典型病变结节接种于血液琼脂平板培养基上，置于37 温箱中培养。24 h 后可见到小米粒大小的白色绒毛状菌落，48 h 后菌落增大，60 h 后转为淡绿色，72 h 后菌落转为暗绿色，一个星期后呈黑褐色4。用接种环挑取菌落涂片镜检，可见到曲霉菌的形态结构（菌丝有隔，末端膨大成球状，球上有小梗，有的梗上有孢子存在，状如花冠），符合曲霉菌的特点。根据实验室检查结果再结合病史调查、现场观察、临床症状及剖检变化，可确诊为禽曲霉菌病。（一）直接检查 是最简单而重要方法，浅部感染真菌的病变标本如毛发、皮屑、甲屑置玻片上，滴加10%KOH，覆盖玻片微热熔化角质层，再将玻片压紧，用吸水纸吸去周围多余碱液，在显微镜下观察，见皮屑甲屑中有菌丝，或毛发内部或外部有成串孢子，即可初步诊断为癣菌感染，但不能确定菌种。深部感染真菌标本如痰，脑脊液亦可做涂片用革兰氏染色（白色念珠菌）或愚汁负染色（隐球菌）观察形态特征。 （二）培养检查 本法可确定菌种，辅助直接检查不足，通常用沙保氏培养基（2228），深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37培养，或根据不同菌种运用不同培养基，如孢子丝菌可用胱氨酸血液葡萄糖琼脂，必要时运用鉴别培养基和生化反应，同化试验等进行鉴定。 （三）免疫学试验 近年来有许多方法用于检测深部感染真菌的抗体，作辅助诊断荚膜组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。但系统性感染患者常因免疫功能降低不出现抗体；而且许多真菌间抗原性有交叉反应；有的产生抗体后维护时间较长，正常人群中有一定比例的阳性率，则必须结合临床情况分析结果才能作出恰当的诊断。 由于上述检测抗体受到许多因素的限制，及深部真菌感染时，早期培养阳性率甚低，晚期则多于失去治疗时机，因此用免疫学方法从血清或其他部位检测真菌抗原，对早期诊断具有重要意义。如乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原，ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原及免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原等，均为早期，快速、特异的诊断方法。 （四）动物试验 其些真菌对实验动物有致病性，如皮炎芽生菌，球孢子菌可在小白鼠，豚鼠体内生长，白色念珠接种家兔小白鼠可发生肾脏脓肿致死。 四、防治原则 真菌感染尚无特异预防，主要注意公共卫生和个人卫生，碘化物治疗孢子丝菌病、毛霉菌病有一定疗效。制霉素、灰黄霉素、克霉唑（三苯甲霉唑）等外用或内服过癣症和白色念珠菌病等有较好疗效。近年服道5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗单细胞真菌感染疗效显著。二性霉素B可用于深部全身真菌感染。玻片培养又称小培养，小培养法可以随时观察真菌的生长形态（如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等），还可以随时观察其生长发育的全部情况，有利于菌种的鉴定。1、钢环法（1）材料：白假丝酵母菌、沙保弱培养基、玻片培养又称小培养，小培养法可以随时观察真菌的生长形态（如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等），还可以随时观察其生长发育的全部情况，有利于菌种的鉴定。1、钢环法（1）材料：白假丝酵母菌、沙保弱培养基、无菌玻片、盖玻片、钢环（带有缺 口）、石蜡。（2）方法用无菌镊子取无菌小培养钢环，环的两面分别蘸取熔化的固体石蜡，平置于无菌载玻片上，另取一无菌盖玻片，在酒精灯火焰上加热后覆盖于钢环上，待冷后，小培养钢圈即被固定于载玻片与盖玻片之间。用毛细滴管吸取融化的培养基，从钢环上端孔注入，注入量占容积的1/2即可。培养基冷却凝固后，用接种针挑取材料，由上端孔接种于环内培养基上。置湿盒内，室温或37下培养23d后，逐日观察，镜下可连续看到真菌生长过程及菌丝、孢子等特征，一般7d左右即可长好。也可不用小培养钢环，直接将融化的培养基滴于无菌玻片上，待冷凝后从周边接种材料，用盖玻片覆盖后培养，在显微镜下连续观察生长情况。（3）结果：镜下观察可见到有胞壁增厚的厚膜孢子及假菌丝。2、小块琼脂玻片培养法用无菌操作法将制好的待用琼脂平板用无菌接种针或接种环切成大约1cm2的方块，将其放置于灭菌的载玻片上。将标本或待检菌接种于琼脂块四周边缘靠上方部位，然后用无菌镊子取一无菌的盖玻片盖在琼脂上。在无菌平皿内放入少量无菌水和一个无菌U形（或V形）玻璃棒。将此载玻片置于玻璃棒上，盖上平皿盖培养。每日用肉眼和显微镜观察孢子和菌丝的特点。涂片找真菌标准操作规程1检验目的：用革兰染色找酵母样菌，为临床感染的初步诊断和用药提供依据。2适用范围：各种涂片标本（主要如白带等）3检验原理3.1真菌的染色结构如革兰阳性菌细胞壁。3.2经过革兰染色后变成紫色，体形较细菌大容1检验目的：用革兰染色找酵母样菌，为临床感染的初步诊断和用药提供依据。2适用范围：各种涂片标本（主要如白带等）3检验原理3.1真菌的染色结构如革兰阳性菌细胞壁。3.2经过革兰染色后变成紫色，体形较细菌大容易辨认。4试剂：4.1试剂厂家：珠海贝索生物科技公司4.2包装规格：250ml44.3试剂盒组成4.3.1龙胆紫（龙胆紫、乙醇）4.3.2碘溶液（碘、碘化钾）4.3.3脱色液（丙酮、乙醇）4.3.4沙黄溶液（沙黄、乙醇）5仪器设备：奥林巴斯双目显微镜6操作程序6.1涂片：用无菌接种环取一环无菌生理盐水于玻片上，再用无菌接种环挑取所需菌落，在玻片的生理盐水上均匀涂抹，自然晾干。6.2固定：6.3将龙胆紫液（Crystal Violet）滴加在已固定的涂片上，染10秒钟后，水洗并甩干。6.4滴加碘溶液（Iodine Solution），10秒钟后水洗并甩干6.5再滴加脱色液（Decolorizer），脱色1020秒（或摇动玻片至紫色不再脱落为止，根据涂片之厚薄之需要），水洗并甩干。6.6加沙黄溶液(Safranin Solution)复染10秒之后水洗。6.7以滤纸吸干或在空气中自然干后，油镜镜检。7结果观察7.1有真菌孢子及菌丝出现报告：找到真菌。7.2无真菌孢子及菌丝出现报告：未找到真菌。8质量控制：大肠埃希菌呈G杆菌；金黄色葡萄球菌呈G球菌。9注意事项9.1涂片不能太厚，并且要均匀，否则菌体堆积或分散不匀，会影响染色结果。9.2脱色要至无蓝色脱落为止。9.3火焰固定时，应避免菌体过分受热而皱缩变形，影响结果的判断。9.4每次染色时应用大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌作阴阳性质控对照。10临床意义：辅助临床判断是否是药物引起的菌群失调或真菌感染。11支持文件：全国临床检验操作规程（第三版）表3鼻咽喉标本标本类型采集时间和温度重复采样限制说明原则装置和最小量转运储存鼻用预先被无菌盐水湿润的拭子插入鼻孔约2cm，对着鼻粘膜用力旋转，蘸取粘膜上分泌物，缓慢抽出，将拭子直接送检。拭子转运2h,常温24h,常温1/d喉用压舌板压舌，用无菌拭子从咽后、扁桃体和发炎区域采样，不要碰触舌头和面颊。拭子转运2h,常温24h,常温1/d喉拭子培养不能用于会厌发炎的患者。主要病原菌：A群溶血链球菌可选择性报告：溶血隐秘杆菌表6粪便标本类型采集时间和温度重复采样限制说明原则装置和最小量转运储存常规培养直接置入一清洁、广口的无菌容器无菌容器2g或者1.5ml1h,常温1/d住院时间超过3 d或入院诊断不是胃肠炎的患者不做常规粪便培养。对这些患者应进行梭状芽孢杆菌的培养或毒素检测。梭状芽孢杆菌将液体或软大便直接送入清洁、广口无菌容器内。无菌容器：2g或者1.5ml1h,常温1-2h,424h,-20培养：2 d，4，3 d， 4或-70更长用于毒素检测1/2d患者应该是每24h排泻液体或软大便5次的患者。-20冷冻易于使细胞毒素快速丢失。EcoliO157:H将液体或血便放入一清洁、干燥的容器无菌容器2g或2ml1h,常温24h, 41/d有腹部痉挛的患者在发病6小时内采集到的血或液状便效果更好直肠拭子1.小心插入无菌拭子超越肛门括约肌约2-4cm2.轻轻旋转拭子，在肛门隐窝取样3.用于检