基因工程基本操作程序.ppt

1.2 基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的基因,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,阅读教材P8-11,如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。,1、从基因文库中获取目的基因,（1）.基因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分 基因，如：cDNA文库,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质 ,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上 游的RNA聚合酶结合位点:,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,与RNA聚合酶结合位点,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,转录,翻译,转录,翻译,1下列关于基因结构的认识中，正确的是 （ ） A大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列 B乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子 C大肠杆菌基因与RNA聚合酶结合位点位于编码区的下游 D水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列 2（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点是 （ ） A编码区都有能编码蛋白质的序列 B编码区都是连续的 C非编码区都能调控遗传信息的表达 D非编码区都有RNA聚合酶结合的位点,D,ACD,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,（2）.基因文库的构建方法,基因组文库的构建,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存, cDNA文库的构建-反转录法：,mRNA,RNADNA杂合双链,单链DNA,双链DNA,逆转录,（cDNA）,DNA聚合酶,真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？,思考？,编码区,非编码区,非编码区,DNA聚合酶,剪接有关的酶,RNA聚合酶,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含非编码系列。即不含非编码区和内含子,（3）构建基因文库的目的,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。,依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,（4）从基因文库中得到目的基因的方法,直接分离法(鸟枪法),直接分离法,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(鸟枪法),回顾必修课中目的基因的获取方法有哪些？,多用于原核生物,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,与运载体连接导入,基因组文库,cDNA,受体菌群体,与运载体连接导入,部分基因文库 （cDNA文库）,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,某种生物某个时期的mRNA,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,2、利用PCR技术扩增目的基因, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。,原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,PCR技术,原理： 前提： 原料： 优点 过程：,PCR扩增仪,DNA复制,已知目的基因的一段核苷酸序列,：以_方式扩增， 在短时间内大量扩增目的基因,指数,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子,变性,复性,延伸,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,条件：_、 _、_ 、 _ 、前提条件:_, 结果：,模板DNA(含目的基因),四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶,指数,2n,使_在短时间内成百万倍地扩增,已知基因的核苷酸序列,含目的基因的DNA片段,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、边解旋变复制,半保留复制、全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,3、人工合成法：,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成,化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,反转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,人工合成法（真核生物）,推测,推测,单链DNA,合成,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,一、目的基因的获取,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,课堂小结：,2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,1在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法 B、基因组文库法 C、CDNA文库法 D、聚合酶链反应,4、 在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（ ）个,A. 540 B. 8100 C. 17280 D. 7560,3、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A B C D,D,加热至95摄氏度的目的是使DNA中的 断裂，这一过程在细胞内是通过 的作用来完成的。 当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成2个DNA分子，此过程中的原料 ，遵循的原则是 。 Taq酶的特点是（ ） A.耐强酸 B.耐强碱 C.耐高温 D.最适温度37摄氏度,在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶 引物 温度变化 恒温 A B C D,D,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。 （2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程:,基因表达载体的构建,外源DNA,质 粒,酶切位点,酶切,酶切,混合,DNA连接酶,利用粘性末端进行DNA片段和载体DNA的体外重组,目的基因与运载体结合,基因表达载体的构建核心,质粒,DNA分子,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种 限制酶,2.基因表达载体的组成：,它们所处的位置和有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,3、基因表达载体的作用,a使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶 具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA连接酶 四种脱氧核苷酸 ATP A B C D,（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,D,下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码 B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用 C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,常用的受体细胞：,原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌 真核生物：酵母菌和动植物细胞,将目的基因导入受体细胞,转化：,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,方法： 将目的基因导入植物细胞： 农杆菌转化法（双子叶植物和祼子植物） 基因枪法（单子叶植物） 花粉管通道法 将目的基因导入动物细胞 显微注射法 将目的基因导入微生物细胞 感受态细胞（用Ca2+处理）；电激或热激,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒 目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色体DNA,新性状,农杆菌,整合到染色体上,转移至受体细胞,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,常用于单子叶植物的转化方法,（2）基因枪法微弹轰击法,特点：成本高,适用于单子叶植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,早期胚胎,新性状动物,2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,将目的基因导入受体细胞,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,3.将目的基因导入微生物细胞,Ca2+处理,小结,比较目的基因导入不同细胞的方法,农杆菌转化法,显微注射法,Ca2+处理法,体细胞,受精卵,原核细胞,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少 2、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞 A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达,C,目的基因的表达和检测,抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等,抗原抗体杂交法,DNA-RNA分子杂交法,DNA分子杂交法,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等,个体水平的鉴定,目的基因的表达和检测,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 (关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA .用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针 .使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分子杂交,方法:,抗原抗体杂交,过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,1、鉴定分子水平的鉴定,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是 检测受体细胞中是否有目的基因 检测受体细胞中是否有致病基因 检测目的基因是否转录出mRNA 检测目的基因是否翻译出蛋白质 A B C D,C,采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是 将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导人细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 A B C D,C,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法、 Ca2+处理 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：,有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,C,基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A、人工合成目的基因 B、目的基因的检测和表达 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因与运载体结合,（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到 A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接 B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增 C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状 D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”,ABCD,培养,培养,培养,导入,含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌,含有氨苄青霉素 的完全培养基,含有四环素的完全培养基,两种培养基均不能生长大肠杆菌,Ca2+ 处理细胞形成感受态细胞,检测,（培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌）,只有氨苄青霉素抗性基因质粒,只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌,不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌,完全培养基,导入,接种培养,接种培养,接种培养,含有四环素的完全培养基,完全培养基,大肠杆菌不含抗四环素基因,证明：,不存活,含有四环素的完全培养基,证明：,大肠杆菌的受体细胞含有目的基因,四环素抗性基因,四环素抗性基因,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,存活,导入,接种培养,接种培养,接种培养,接种培养,含有四环素的完全培养基,完全培养基,大肠杆菌不含抗四环素基因,证明：,不存活,含有四环素的完全培养基,证明：,大肠杆菌含抗四环素基因,证明：,大肠杆菌的受体细胞含有目的基因,四环素抗性基因,四环素抗性基因,完全培养基,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,4. 在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。右图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答：来源:学,科,网,(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤:目的基因的获取、_、 将目的基因导入受体细胞、_。(2)A过程需要的酶有_ _。,基因表达载体的构建,目的基因的检测与鉴定,（同一种）限制酶和DNA连接酶,（3）要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用_处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为_态；然后将_在缓冲液中混合培养完成转化过程。 （4）含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后，将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过C_和E_。如要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培养基中加入_。,Ca2+,感受,重组质粒和感受态细胞,脱分化,再分化,卡那霉素,（5）如果转基因植物的花粉中含有毒蛋白，将引起的安全性问题包括_。 A.生物安全 B.环境安全 C.食品安全 D.伦理道德问题 （6）抗虫基因能与植物体内基因拼接成功是因为 _ _。 成功表达说明苏云金杆菌和植物等生物共用 _ 。,ABC,抗虫基因与植物的DNA的双螺旋结构相同,一套遗传密码,（7）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基 因的传递符合孟德尔遗传定律。,将转基因植株与_杂交，其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1:1。,若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为_,若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得的再生植株中抗卡那霉素型植株占_,非转基因植株,3:1,100,1. 金花茶是中国特有的观赏品种，但易得枯萎病，降低观赏价值。科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，用转基因方法培育出了抗枯萎病的新品种。请据图回答：,（1）将连接到并形成的最大区别：的基因结构的编码区内有_和_；而是_，它的基因结构的特点是_，常用到的酶是_和_。,；,外显子,内含子,质粒,基因的编码区是连续的，不间