RNi技术原理及应用.ppt

RNAi技术原理及其应用,2013.10.15,什么是RNA干扰？,RNA干扰( RNA interference , RNAi )是指由与靶基因序列同源的双链RNA (double-strand RNA，dsRNA)所诱导的mRNA特异性降解，从而使基因转录后沉默的一种现象(Fire A,2002)。 2002年美国科学杂志将其评为全球年度十大科学进展之首,1 RNAi现象的发现及发展,RNAi的发现,2 RNAi的作用机制,2.1转录水平的基因沉默,RNA分子介导的转录水平的基因沉默（transicriptional gene silencing，TGS）是指基因信息从DNA到mRNA的转录过程尚未启动时，siRNA分子通过修饰染色体DNA分子或与其结合的组蛋白分子阻碍转录的发生,2.2转录后水平的基因沉默,RNA分子介导的转录后水平的基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS） PTGS是指基因信息从DNA到mRNA的转录过程启动后，siRNA分子通过RNA干扰机制降解mRNA或抑制mRNA翻译，也包括在转录启动后siRNA介导的基因第一外显子序列的DNA甲基化。,2.3RNAi的主要过程,起始阶段 dsRNA (500nt左右最佳)被Dicer 酶特异性识别，以一种ATP依赖的方式逐步切割成siRNA Small interfering RNA (siRNA)长度：21-25nt Dicer是一种ATP依赖性RNase型核酸内切酶，对单链RNA没有活性，对200500nt的dsRNA作用效果最好,siRNA的结构,2.效应阶段 siRNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC） 的形成 RISC中解旋酶可依靠ATP供能，解开siRNA 双链，激活RISC 在siRNA反义链的指导下(靶序列的识别），RISC中核酸内切酶特异性切割、降解靶mRNA，导致基因表达失活,3.siRNA扩增阶段 RNA依赖性的RNA聚合酶 (RNA dependent RNA Polymerase, RdRp) siRNA可作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链，它在Dicer酶的作用下也被裂解成新生的siRNA。通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。,RNAi作用机制,2.4miRNA介导的RNAi,MicroRNAs( miRNAs)是一种大小约为21-25个碱基的非编码单链小分子RNA，是具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体(pre-miRNA)经过Dicer酶加工后生成(Lee Y,2003)。 miRNA的功能也是由RISC介导的，最终引起蛋白质翻译受抑或者同源mRNA降解（Bartel D P.，2004）。,Table1.miRNA和siRNA介导RNAi的区别,3昆虫RNAi技术的实验方法,RNA干扰研究的一般流程,RNAi实验对照设置,Table 2.RNAi实验对照设置,1.dsRNA模板的选择 选择的dsRNA模板区域不要针对5和3端的非编码区 通常选择的模板长度约为500bp 在合成dsRNA之前，应该先进行dsRNA和其他mRNA的同源性比对,3.1dsRNA的获得,3.2dsRNA的合成方法,1.体外转录法 原理：采用5-末端含有T7、Sp6或T3 RNA多聚酶识别序列的寡核苷酸引物进行PCR扩增目的片段，然后在T7 、Sp6或T3RNA多聚酶的作用下转录成RNA，通过简单的退火、核酸酶消化和离心等步骤后即可获得dsRNA,用于制备长度范围在200bp-1000bp的dsRNA 采用Ambion专利的体外转录技术，能合成达 5080 g 的双链RNA 试剂盒包括dsRNA纯化试剂,dsRNA合成MEGAscript RNAi Kit,2.构建RNAi表达载体制备dsRNA,表达载体可分为两个类型 ： 单启动子载体，需要插入反向重复DNA（由正义链、间隔序列和反义链组成），在转录的过程中，反向重复序列可产生由内部碱基互补而回折形成的发夹RNA分子，然后加工形成dsRNA ； 双驱动子载体，将靶DNA置入克隆位点后，双启动子分别表达正义链和反义链，然后在胞内结合形成dsRNA,单启动子载体,双驱动子载体质粒L4440,DNA模板,（Timmons和Fire，2001）,3.3昆虫RNAi的导入方法,dsRNA微量注射法,Nanoject II Auto-Nanoliter Injector,Table3.昆虫RNAi的导入方法,4RNAi技术在昆虫学研究中的应用,特点：高效、特异性强、快速且经济 RNAi技术基因功能研究的优点： RNAi技术不破坏基因的完整性，可以先将特定基因的表达封闭，然后再激活 可以同时封闭基因家族或具有高度相似性的一组基因，从而解决由于多个基因的功能沉余造成的难于检测到单个基因突变表型的问题,Table4.RNAi research on functional genes in insects,续Table4.RNAi research on functional genes in insects,续Table4.RNAi research on functional genes in insects,续Table4.RNAi research on functional genes in insects,续表Table4.RNAi research on functional genes in insects,4.3RNAi技术在害虫控制的应用,5.1 Five important factors largely influencing the silencing effect,1.靶标基因沉默导致害虫死亡,Bettencourt等(2002)利用RNAi技术对刻克罗普斯蚕蛾（Hyalophora cecropia）的抑血细胞聚集素基因（Hemolin）进行研究，发现RNAi后雌虫交配产卵，由于胚胎畸形，不能够孵化出幼虫。,R. Bettencourt*, O. Terenius and I. Faye (2002),Table 4. Impact of parent male RNAi on embryonic malformation,2.转基因植物持续提供dsRNA,Baum et al. (2007)对玉米进行了基因改造，使其液泡表达玉米根萤叶甲（Diabrotica virgifera virgifera）的一种关键酶(V-ATPase)为靶标的dsRNA，结果表明能够减轻害虫对植物的危害。,Non-transgenic corn Transgenic corn,(Baum et al., 2007),Mao等（2007）将棉铃虫（H .armiger