培养基常用器皿的灭菌方法.ppt

1,液体培养基的灭菌,2,概述,发酵过程中灭菌的方法： 化学物质灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、 辐射灭菌、过滤介质除菌,石炭酸 （苯酚 ）： 2%5%，器械、环境的喷雾消毒 来苏尔： 2%，皮肤消毒 新洁尔灭 （苯扎溴铵 ）：0.25%，无菌室喷雾消毒，皮肤器械表面消毒 甲醛： 气体挥发杀菌，处理 染菌罐、厂房定期消毒 漂白粉： 10%，环境、车间下水道、地沟等污染源消毒,3,发酵罐甲醛消毒 -首先将发酵罐彻底清洁干净，加入发酵罐容积1/10000的甲醛溶液，将罐温升至85度并保温30分钟。 -保温结束后，排冷凝水，加入发酵罐容积90%的水，将罐温升至120度保温2030分钟，保温结束待罐温下降后将水排走，最后再用水清洁罐内壁及各部件。 -记得做好劳动保护，比如口罩、眼罩、手套等。,4,灭菌的实际操作,（一）空罐灭菌 也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是补料罐、消泡罐，当物料未进罐前对罐进行的预先灭菌 空罐罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长 通常空罐灭菌大都控制在 127-133 （压力 0.15-0.2MPa），灭菌时间 30 -60 min。,5,实罐灭菌（间歇灭菌）,操作： 进料完毕，开搅拌以防料液沉淀 开夹套蒸气阀，使料液预热升温至70-95,关搅拌 关闭夹套蒸气阀门，开空气、出料、取样三个阀门进蒸气，开排汽阀，包括小辫子（进料管、补料管、接种管）和排汽管。 升温至121 ，保温30min（实际上要计算确定） 保温结束，关过滤器排气阀、进汽阀，关夹套下水道阀，开冷却水进水阀。 待罐压低于过滤器压力时，通入无菌空气，开搅拌，降温至培养温度。,实罐灭菌,灭菌升温 分两个时期 蒸汽间接加热到70-95左右，再直接加热至121 工厂设计时，对升温阶段，主要计算： 间接、直接加热阶段的 加热所需时间 间接、直接加热阶段的 蒸汽耗量（二者公式相同，结果相加即是升温时的蒸汽总耗量）,7,在实际灭菌中，在升温阶段就有部分杂菌被杀死，特别是加热到100以后，此作用更明显，因此所需保温灭菌时间比计算结果要小。 一般认为，灭菌时间可减少10%左右 但小罐（ 40m3以下）实际生产中不考虑，保险一些 大罐的升温时间长，为减少培养基营养损失，应考虑此影响 （计算方法有兴趣的同学可参考陈国豪的生物工程设备一书）,8,保温阶段的蒸汽耗量,在保温阶段，活蒸汽仍不断通入发酵罐，由发酵罐顶若干出口排出 此段蒸汽耗量可估算为： 直接加热的蒸汽耗量的30-50% 40m3以上的罐，取30%， 40m3以下的罐，取50% 如，一个10m3的罐，升温时直接加热用蒸汽1.6吨，则保温时用约0.5-0.8吨。,9,（三）培养基连续灭菌流程,培养基连续灭菌的优点 高温瞬时灭菌，物料受热时间短，营养成分破坏少； 总的灭菌时间较实罐灭菌大为减少 蒸汽负荷均衡，可避免用气高峰，锅炉利用率高。,10,培养基连续灭菌的缺点,涉及设备多，能耗大 对总蒸汽压力要求高 操作繁杂 物料焦化结垢经常发生，要时常检查清理 培养基中不含有固体颗粒或泡沫较少 时适用,11,系统：加热（连消塔/喷射加热器）、维持（维持罐/维持管）与冷却（喷淋/薄板换热）三部分 与淀粉质原料的糖化流程的功能分工很像 操作过程： 先用蒸汽对整个工艺流程中的有关设备进行消毒，然后，将底物或培养基连续通过设备进行消毒,培养基连续灭菌流程,12,（三）培养基连续灭菌流程,13,14,连消步骤,培养基在配制罐中预热到60-70 连消泵连续打入加热设备内，要求在20-30s 或更短的时间内将培养基加热到130-140 进入维持设备，保温一定时间。 进入冷却设备，冷却至发酵温度 要计算的常有：蒸汽用量、维持时间、维持管长或维持罐容积、连消塔参数,15,加热设备 之一：连消塔 连消塔用内外两根管子套合组成，内管开有45向下倾斜的小孔。 培养基由塔底进入，在塔内环隙中流动，从塔上部流出。 要求在2030s或更短的时间内将料液加热至130140。 生产中一般用0.50.8Mpa的活蒸汽与预热后的料液直接接触加热 塔有效高度为2-3m。,16,加热设备 之二：喷射式加热器 左图为一种改进的连消塔，功能已经接近喷射式加热器 右图为喷射式加热器，结构已经在淀粉质原料的蒸煮糖化设备中讲到。,17,维持设备,维持罐和维持管两类，其设计关键，在于物料在其中的停留时间的确定。 停留时间，相当于间歇灭菌的121度保温的时间的功能 但不能用对数残留定律简单计算，实际中，返混的因素要考虑。,18,维持罐 使用最广泛 要求返混要小，故高径比取为2.0-2.5，外壁有保温层 物料在其中的停留时间计算得到的理论灭菌时间（3至5倍）,19,维持管,比维持罐更减少了返混 为保证平推流状态，培养基流速约0.25-0.6m/s 则可根据设计要求的培养基体积流量，计算得到管径,培养基的线速度物料停留时间=管长 故，物料的停留时间 计算，是管长计算的关键,20,冷却水,生培养液,蒸汽,维持段,灭菌后培养液,薄板换热器连续灭菌流程,21,薄板换热器与连消塔结合连续灭菌流程,发酵罐甲醛消毒 -首先将发酵罐彻底清洁干净，加入发酵罐容积1/10000的甲醛溶液，将罐温升至85度并保温30分钟。 -保温结束后，排冷凝水，加入发酵罐容积90%的水，将罐温升至120度保温2030分钟，保温结束待罐温下降后将水排走，最后再用水清洁罐内壁及各部件。 -记得做好劳动保护，比如口罩、眼罩、手套等。,常用设备的灭菌,设备、管道灭菌条件,1. 杀菌锅内灭菌 固体培养基灭菌：压力0.098MPa，维持2030min； 液体培养基灭菌：压力0.098MPa，维持1520min； 玻璃器皿及用具灭菌：压力0.098MPa，维持3060min。 2. 种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐及管道灭菌从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147MPa，维持45min。,3. 空气总过滤器和分过滤器灭菌 维持压力0.147MPa，灭菌2h 4. 种子培养基实罐灭菌 从夹层通入蒸汽间接加热至80 ，关闭夹层蒸汽的进口阀门、升温121 ，30min 谷氨酸发酵的种子培养基实罐灭菌为110 ，维持10min,5.发酵培养基实罐灭菌 121 ，30min，谷氨酸实消105 ，维持5min 6. 发酵培养基连续灭菌 一般培养基130 ，维持5min 谷氨酸发酵培养基为115 ，68min,7. 消泡剂灭菌 直接加热至121 ，30min 8. 补料罐灭菌 根据料液不同而异，淀粉质原料121 维持5min 9. 尿素溶液灭菌 105 ，5min,发酵罐的灭菌,培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法，则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1kg，20min。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。,注意事项：,先将罐内空气排尽，灭菌时要保持蒸气畅通，使有关阀门、管道彻底灭菌；,严格检查有关罐体、管道、法兰、轴封、阀门等有无渗漏、穿孔、堵塞、死角以及有无阀门忘开、忘关、开关次序搞错，泡沫冒顶和逃液等不正常现象；,在配料时应开搅拌器，尽量将各种粉饼等团块打碎，搅拌均匀，防止结块或大颗粒对其内部微生物的保护；,淀粉配比超过4%时必须水解，否则影响灭菌效果；,灭菌时，罐盖面上的玻璃视镜必须用橡皮垫盖好，以防沾着冷水引起炸裂。,附属设备灭菌,发酵罐的附属设备：分空气过滤器，补料系统、消沫剂系统等。 （1）分空气过滤器在发酵罐灭菌之前进行灭菌，灭菌后用空气吹干备用。 （2）补料罐的灭菌温度视物料性质而定，如糖水，灭菌时蒸气压力为0.1Mpa（120），保温30min。,（3）油罐（消沫剂罐）灭菌时，其蒸气压力为0.150.18Mpa，保温60min。 （4）补料管路、消沫剂管路与补料罐、油罐同时进行灭菌，但保温时间为1h。 （5）移种管路灭菌一般要求蒸气压力为0.30.45Mpa，保温1h。上述各种管路在灭菌之前，要进行严格检查，以防泄漏和“死角”的存在。,补料液的灭菌,灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。 如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。 也有利用过滤法对另补料液进行除菌。 补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。,空气灭菌,第一节 空气中微生物的分布和发酵工业对空气无菌程度的要求,一、无菌空气的概念 发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。,无菌空气的标准 百分数：99.99 美国联邦宇航局等级标准： 100级 温度：25 40 湿度：30%45%,二、空气中微生物的分布 空气中的含菌量随环境不同而有很大差异： 一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少，而潮湿温暖的南方则含菌量较多； 人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多； 地面又比高空的空气含菌量多。 各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为103104个m3进行计算。,各种不同的发酵过程，对空气无菌程度的要求也不同。影响因素是比较复杂的，需要根据具体情况而订出具体的工艺要求。 一般按染菌机率为10-3来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许12次染菌。,三、发酵对空气无菌程度的要求,第二节 空气除菌的方法,辐射灭菌 加热灭菌 静电除菌 介质过滤,1，原理 射线、X射线、射线、射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。,一、辐射灭菌,2，应用范围 通常用于无菌室和医院手术室。 3，缺点 杀菌效率较低，杀菌时间较长。一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度。,原理:利用空气压缩时产生的热进行灭菌。 空气进口温度为21C，出口温度为187198C，压力为0.7MPa。,二、加热灭菌,利用压缩热进行空气灭菌的流程图,1，原理 利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的。,三、静电除菌,2，优点 阻力小，约1.01325104Pa 染菌率低，平均低于10-15 除水、除油的效果好 耗电少 3，缺点 设备庞大 、一次性投资较大 、捕集率尚嫌不够，需要采取其它措施。,滤材,孔,过滤除菌 利用有孔介质从气体中除去微生物,四、介质过滤除菌,一个空气过滤器的功能是从气体中去除污染物（微生物）以使达到所需的气体的无菌程度。,空气过滤器的功能,过滤器的功能,过滤器经常被认为是一种简单的网或筛子， 过滤 / 分离是在一个平面上进行的。,过滤器的功能,实际上，空气过滤器的滤材具有深度。“弯曲通道”的结果对于污染物的去除起到了辅助作用 。,直接拦截 惯性撞击 扩散拦截,过 滤 机 理,第三节 介质过滤除菌的工艺,空气过滤除菌流程是按生产对无菌空气要求具备的参数，根据空气的性质而制订的，同时还要结合吸气环境的空气条件和所用设备的特性进行考虑。 对于一般要求的低压无菌空气，可直接采用一般鼓风机增压后进入过滤器，经一、二次过滤除菌而制得。 而一般的深层通气发酵，除要求无菌空气具有必要的无菌程度外，还要具有一定的压力，这就需要比较复杂的空气除菌流程。,一、对空气除菌流程的要求,流程的设备： 主设备：空气压缩机 附属设备：要求尽量采用新技术，提高效率，减少设备，精简设备流程，降低设备投资、运转费用和动力消耗，简便操作。 流程的制订应考虑： 地理、气候环境 设备条件,二、空气过滤除菌流程的分析,发酵厂所使用的空气除菌流程，随各地的气候条件及设备条件不同而有很大的差别。 要保持过滤器有比较高的过滤效率，应维持一定的气流速度和不受油、水的干扰。气流速度可由操作来控制；要保持不受油、水干扰则要有一系列冷却、分离、加热的设备来保证空气的相对湿度在5060的条件下过滤。,发酵生产中制备无菌空气的大致过程,高空取气管是远离地面几十米的管子。一般而言，地面附近空气中所含的微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，据资料介绍，每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级，因此从高空取气要比从低空取气有利得多。,空气介质除菌流程,1，两级冷却、分离、加热的空气