微生物遗传育种,基因突变.ppt

第二章 基因突变和诱变育种,第一节 概述： 突变的定义及其分类,一、突变的定义,突变的概念最早是由荷兰植物学家 H. de. Vries于1901年提出的。他在自家的菜地上找到一种野生型的拉马月见草（Oenothera lamarckiana）这种植物具有惊人的产生遗传新类型的性质， de.Vries把这些新类型称为“突变”。,突变包括染色体数量的变化和染色体上基因本身的变化等多种多样的现象。,染色体较大范围结构的变化称为染色体畸变（Chromosomal aberration），即DNA的大段变化（损伤）的现象。染色体上基因本身的变化称为基因突变（Gene Mutation）。染色体数量变化和染色体畸变对进化学家和植物育种学家来说相当重要，对于微生物遗传及育种来说不如基因突变重要。,二、基因符号与命名规律,1946年，J.lederberg发现细菌杂交时，E.coli菌中所报导的突变型不过十几个，大约二十年后，在E.coli中已经定位的基因有650个，大约又十年后增加了200个，到1983年这个数字已经增加到1027个。,基因命名规则：,1、每一个基因座位都用斜体小写的3个字母来表示，一般这三个字母是代表该基因的一个或两个或三个英文单词的前三个字母。如色氨酸基因trp（tryptophan），但也有例外，如xis（excision）是切除修复基因。,2、产生同样表型的不同基因座位，在上述斜体小写的英文3个字母后加上一个斜体的大写字母以示区别，如trp A。,3、一个基因的不同突变位点是在这个突变基因座位符号后，按分离先后次序用数字来表示，如果不知道这些突变属于哪一个基因座位，则用“”来代替。 如trp A 23,trp 54,4、表型特性同样用3个字母来表示，但第一个字母大写，以便于基因符号清楚的区别。,5、细菌对抗生素和phage的抗性突变表示为r，野生型的菌对抗生素和phage均为敏感型s，写突变体基因型可以写strr或str-r或strB strA，写表型时，Strr。,6、一般用“”表示一个座位野生型等位基因，“”表示突变型等位基因，一般不写“”。,7、菌株用简单的序号表示，不同的实验室采用不同的英文字母作字首，菌株编号不用斜体。一个菌株第一次在论文中出现时，应详细描述其基因型及相关表型。,菌株编号 性别 基因型 表型 E.coli CSH1 F trpB Trp lacZ Lac thi B1 strA strr,8、当染色体上存在缺失时，可用“”来表示，缺失的部分表示在“”符号后面的括号中，例如（Lac, pro）表示染色体上乳糖发酵基因到脯氨酸基因这一段染色体发生缺失。,9、在基因符号书写时，一般应先写生化缺陷标记，然后是糖发酵标记、抗药性标记和形态变异标记，最后是象phage一类附加体在细菌中的存在状态或细菌对这类附加体的反应和抑制基因的符号。,例如： CGSC4252: F 105T thr-1 leuB6 thi-1 argE3 his-4 proA2 recA13 lacY1 galK2 mtl-1 xyl-5 ara-14 rpsL31 tsx-33 - supE44,三、突变的分类,1、按照突变生成的过程（或原因）来看：可分为自发突变和诱发突变。,2、从DNA碱基序列改变多少来分可分为单点突变和多点突变。,3、从阅读框架的影响来看有所谓的移框突变。,4、从对遗传信息的改变来看可将点突变中的碱基替代进一步分为：同义突变（synomymous mutation）,错义突变（missense mutation）,无义突变（nonsense mutation）。,5、从突变的效应背离或返回到野生型这两种方向来看分为正向和回复突变两种。,6、从突变的位点存在于负责基因调控的DNA序列当中来看分为启动子上升突变和下降突变。,7、从基因突变所带来的表型改变来看分为选择性突变和非选择性突变。,第二节 基因突变的规律,一、不对应性 即突变的性状与引起突变的原因无直接对应关系。,波动试验(Fluctuation test) 又称变量试验或彷徨试验,第二节 基因突变的规律,1943年，S. E. Luria和M. Delbrck发表了利用波动试验研究细菌抗噬菌体突变的论文，揭开了细菌遗传学的新篇章。,第二节 基因突变的规律,Luria等的波动试验,2. 涂布试验 (Plate spread或Newcombe experiment),第二节 基因突变的规律,1949年，H. Newcombe设计了一种与波动试验相似，但方法更为简单的证实突变自发性的试验涂布试验。,第二节 基因突变的规律,Newcombe的涂布试验,第二节 基因突变的规律,3. 影印试验 (Replica plating),1952年，J. 和E. Lederberg夫妇发明了一种直接证明突变自发性的方法 -影印培养法，证明了细菌的抗药性是发生在加入药物之前的，而药物的作用仅是把突变型筛选出来。,第二节 基因突变的规律,Lederberg等设计的平板影印培养法,第二节 基因突变的规律,二、自发性,各种性状的突变，可以在没有人为的诱变因素下自发地发生。,第二节 基因突变的规律,三、稀有性,自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的，一般在10-610-9之间。但特定微生物的某一特定性状的突变率是一定的。,第二节 基因突变的规律,1 突变率的概念,突变率的一般定义为: 任何一个菌体在一定时间内所发生突变的几率。,突变速率(mutation rate): 是指在每世代每细胞(或个体)发生的特定的突变事件的平均几率(mutation per cell per generation)。,第二节 基因突变的规律,1 突变率的概念,突变频率 (mutation frequency): 是指在群体内突变型的频率。它未必能反映突变发生的速率。因此，我们常说的突变率是指突变速率。,第二节 基因突变的规律,2 突变率的计算,式中 M为突变率， mt是t时的突变细菌数， m0为零时的突变细菌数， nt为t时细菌总数， n0为零时的细菌总数。,第二节 基因突变的规律,2 突变率的计算,例:有一株Tons E. coli菌,从103个细胞/ml培养至108/ml，涂于营养琼脂平皿上，喷上T1噬菌体,经培养后,长出10个Tonr菌株.求突变率。,第二节 基因突变的规律,四、独立性,突变的发生一般是独立的，即在某一群体中,既可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素的突变型或其它药物的突变型，而且还可发生任何性状的突变型.某一基因的突变,既不提高也不降低其他任何基因的突变率。,第二节 基因突变的规律,五、诱变性,某些物理化学因素显著提高突变率的作用称为诱变.通过诱变剂的作用，可以提高自发突变的几率，一般可提高10105倍。,第二节 基因突变的规律,六、稳定性,七、可逆性,第三节 诱变的机制,一、碱基类似物在DNA复制时的掺入,第三节 诱变的机制,1. 5-溴尿嘧啶（5-BU）,第三节 诱变的机制,2. 2-氨基嘌呤（2-aminopurine， 2-AP）,第三节 诱变的机制,第三节 诱变的机制,二、DNA分子上碱基的化学修饰,第三节 诱变的机制,1. 亚硝酸（nitrous acid）引起的氧化脱氨反应,凡是含有NH2的碱基（A，G，C）都可以被亚硝酸作用，产生氧化脱氨反应，使氨基变为酮基，然后改变配对性质，造成碱基转换突变。,第三节 诱变的机制,第三节 诱变的机制,2. NH2OH的致突变作用,羟胺（HA）是一种重要的化学诱变剂，但其作用机制比较复杂。在不同的pH和不同的NH2OH浓度时有不同的产物。在pH6.0，浓度0.11.0mol/L时，它专一地与胞嘧啶起反应，将胞嘧啶转变为只能与A配对的修饰碱基羟基亚胺（Hydoxylimine）碱基，从而导致GCAT的转换。,第三节 诱变的机制,第三节 诱变的机制,3. 烷基化试剂的致突变作用,（1）烷化剂的概念：,生物学上的烷化剂是指在正常生理条件下，能将烷基转移给重要的生物分子的一类化合物。,第三节 诱变的机制,（2）烷化剂的分类：,根据分子中反应烷基数目（即功能基）的多寡，可将烷化剂分成单功能或多功能的烷化剂两大类。,第三节 诱变的机制,（3）常见（用）的烷化剂：,乙基磺酸乙酯（EES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）和亚硝基胍（NTG）等，（详见下表）。,第三节 诱变的机制,第三节 诱变的机制,第三节 诱变的机制,（4）烷化剂的作用机制：,烷化剂能与DNA分子的许多部位发生作用，结果使DNA分子增加了烷基侧链（烷基化作用），从而改变了DNA的分子结构，引起生物体发生突变。,第三节 诱变的机制,A 直接诱发碱基错配：,鸟嘌呤N7位置上的烷化有利于发生电离作用，而离子化的鸟嘌呤则应该具有同T而不是同C配对的倾向，因此，便能产生GCAT的转换。,第三节 诱变的机制,B 错误修复：,鸟嘌呤N7烷化作用的另一种效应是使鸟嘌呤碱基与糖-磷酸的键合削弱，从而导致烷化的鸟嘌呤从DNA上逐渐地脱落下来，这个过程就是所谓的“烷化脱嘌呤作用”。脱嘌呤形成了分子裂缝，在随后的DNA复制过程中便会产生转换或颠换。,第三节 诱变的机制,（5）NTG（NNG）的作用特点：,第三节 诱变的机制,三、嵌合剂的致突变作用,吖啶类染料和ICR类化合物是通过同DNA分子结合而发生诱变作用的两类主要的化学诱变剂。吖啶类化合物主要有原黄素，5-氨基吖啶、吖啶橙等。ICR化合物是指由美国癌症研究所应用化学方法合成的（Institute for Cancer Research)，是一些由烷化剂和吖啶类相结合的化合物。,第三节 诱变的机制,致突变作用的机理：诱发移码突变,吖啶类化合物都是平面的三环化合物，大小和嘌呤-嘧啶对大致相等，在水溶液中能与碱基堆积在一起，并插入到两个碱基对之间，这一过程称为嵌入（intercalation）。一个吖啶分子嵌入后，当DNA分子复制转录时，在顺序中发现一个或两个“额外”碱基，造成识别和阅读错误，产生移码突变。有时也有很低频率的单碱基缺失，引起移码突变。,第三节 诱变的机制,第三节 诱变的机制,第三节 诱变的机制,四、物理因素所诱发的突变,1. 紫外线,第三节 诱变的机制,2. 电离辐射：（直接作用，间接作用）H2OO2OH-HO2-,3. 热诱变的分子机制,第三节 诱变的机制,五、转座子(Transposable elements),1. 概念：,1951年B. Mclintock报导了她长期对玉米颜色变化的观察和研究，推论：玉米染色体上存在一种活动遗传因子（mobile genetic elements或称jumping genes),第三节 诱变的机制,1. 概念：,原核或真核细胞基因组中可以从一个位置转移到另一个位置的遗传因子叫做转座因子。,第三节 诱变的机制,从不同体系中分离到的转座因子往往给予不同的符号表示，如细菌的转座因子：IS（insertion sequence），Tn（transposon）；酵母的转座因子：Ty（transposon yeast）；果蝇的转座因子：Copia或FB(fold back)等等。细菌中可能转座的遗传因子大致可分三类：插入顺序（IS）、转座子（Tn）和某些温和噬菌体（如Mu-1108）。,第三节 诱变的机制,2. 引起突变的机制：,（1）插入突变,（2）转座子所带有的基因,（3）造成染色体畸变,第三节 诱变的机制,3. 转座因子 及转座因子引起突变的表示方式：,4. 应说明的问题：,第三节 诱变的机制,六、增变基因（mutator gene）,1. 概念,2. 机理,第三节 诱变的机制,七、突变热点(hot spots of mutation),1. 概念,2. 突变热点存在的原因：,（1）形成突变热点的最主要原因是5-甲基胞嘧啶的存在,（2）短的连续重复序列的存在,（3）突变热点还与诱变剂有关,第四节 影响诱变发生的因素,一、诱变剂接触DNA分子前,1. 细胞对理化诱变剂透性的影响,2. 细胞质中存在的物质的影响,3. 基因本身所处的状态对诱变的影响,第四节 影响诱变发生的因素,二、DNA损伤修复和基因突变,1. 光复活作用（photoreactivation),（1）现象的发现及概念,1949年，A. Kelner首先在放线菌中发现紫外线照射后的光复活作用。,可见光对紫外线（UV）造成的杀菌或诱变作用的修复过程，叫做光复活作用。,（2）机制,第四节 影响诱变发生的因素,2. 切除修复（excision repair),（1）现象的发现,E. coli的uvr（repair of UV damage to DNA)基因突变可大大提高细胞对UV的敏感性。这一现象使人们推测：uvr突变基因的正常等位基因编码参与由UV造成DNA损伤的修复酶。 1954年 Setlow研究了这一修复过程。,第四节 影响诱变发生的因素,与胸腺嘧啶二聚体切除修复有关的基因有UVrA，UVrB，UVrC和UVrD。似乎UVrABC共同编码一个切除核酸酶（excision nuclease）。UVrD的产物是依赖于ATP或GTP而结合超螺旋DNA的螺旋酶II（Helicase II）。,（2）参与修复的酶,单独的uvrABC基因产物没有内切核酸酶的功能，这几种蛋白质的复合体相互作用，才能使T=T的5-端断裂，uvrABC 编码的内切酶并不是二聚体的专一性酶，它对其它DNA损伤均有切除修复功能。,第四节 影响诱变发生的因素,（2）参与修复的酶,DNA聚合酶I也参与切除修复过程。,既然涉及到DNA的复制，还必需要有连接酶。,第四节 影响诱变发生的因素,（3）切除修复过程 （切除修复模型）,第四节 影响诱变发生的因素,（3）切除修复过程（切除修复模型）,第四节 影响诱变发生的因素,（3）切除修复过程（切除修复模型）,第四节 影响诱变发生的因素,（3）切除修复过程（切除修复模型）,第四节 影响诱变发生的因素,（3）切除修复过程 （切除修复模型）,（4）切除修复与光复活的差异,第四节 影响诱变发生的因素,3. 重组修复（recombination repair),（1）重组修复模型,第四节 影响诱变发生的因素,（2）重组修复机制,（3）与光复活作用和切除修复的区别,第四节 影响诱变发生的因素,4. SOS（紧急呼救）修复,（1）SOS反应的发现,1953年，J. Weigle发现了这样一个现象： 经UV照射的phage感染的E. coli由于大部分的phage已被杀死，不具有感染活性，而存活下来的phage，出现许多突变。如果把经UV照射过的phage感染用低剂量的UV照射过的E. coli，存活的phage数大为增加，同时突变的phage数目也随之增加，这一现象称为W-复活（W-reactivation）,第四节 影响诱变发生的因素,（2）SOS 修复的机制,（2）SOS修复的机制,第四节 影响诱变发生的因素,第四节 影响诱变发生的因素,第四节 影响诱变发生的因素,5. DNA多聚酶的校正,第四节 影响诱变发生的因素,第四节 影响诱变发生的因素,三、环境因素的影响 助变剂：本身没有诱变作用，而对于诱变剂的诱变作用有强化效应的物质。 抗变剂：本身没有诱变作用，但能减弱诱变剂的诱变效应的物质。,第四节 影响诱变发生的因素,四、从突变到突变型,1. 表型延迟,表型的改变落后于基因突变的现象,第四节 影响诱变发生的因素,2. 造成表型延迟的原因,（1）分离延迟: 细菌在生长对数期时，往往在一个细胞中有多个核 ，而突变又往往只发生在一个DNA分子上，所以只有在细胞分裂几次后才会产生突变型菌株。,（2）生理性延迟: 当突变发生时，相应的野生型酶分子并没有改变。经过数次分裂后，这些野生型酶分子已经得到足够的稀释或降解，新的mRNA及蛋白质开始合成，才表现缺陷型细胞。,第四节 影响诱变发生的因素,第四节 影响诱变发生的因素,第五节 自发突变的机制,一、背景辐射和环境因素的诱变 不少“自发突变”实质上是由于一些原因不详的低剂量诱变因素的长期综合诱变效应。,第五节 自发突变的机制,二、微生物自身所产生的诱变物质的作用 1、过氧化氢的作用 2、微生物自身所带的转座因子的作用,三、DNA分子内部运动,第五节 自发突变的机制,（1）互变异构效应 酮基 T、G 酮式和烯醇式两种形式 氨基 A、C 氨基和亚氨基两种形式,第五节 自发突变的机制,第五节 自发突变的机制,（2）碱基自发脱氨 自发脱氨 胞嘧啶 尿嘧啶 自发脱氨 甲基胞嘧啶 胸腺嘧啶,第五节 自发突变的机制,四、环出效应,研究诱变作用的意义： 一是被用于诱变育种工作中 二是在日常生活注意避免接触诱变剂,第六节 致癌物质的测定,Ames试验： 1975年，美国学者B.Ames发明的能够利用微生物来检测药物致癌性的试验方法，同时支持了致癌物质是诱变剂的说法。,第六节 致癌物质的测定,一、Ames试验的目的 检测某种化学药品是否是诱变剂、致癌剂，以及食品、饮料、药物等中是否含有致癌物。,第六节 致癌物质的测定,二、Ames试验的原理 根据“生物化学统一性”的法则,第六节 致癌物质的测定,三、试验菌及对试验菌的要求 试验采用一组鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的His- TA1535 (rfa uvrB hisG46) hisG46是碱基置换 TA1536 (rfa uvrB hisC207) hisC207是移码突变， 可能是GC对缺失 TA1537 (rfa uvrB hisC3076) hisC3076是移码突变， 可能是GC对增加 TA1538 (rfa uvrB hisD3052) hisD3052是移码突变， 可能是GC或CG对缺失,第六节 致癌物质的测定,试验菌的具有如下特点： 1、基本上是单点突变的营养缺陷型 2、丧失了切除修复功能（ uvrB） 3、有一个增加细胞透性的深度粗糙突变,第六节 致癌物质的测定,为什么采用一组已知性质的突变型菌株作为测试菌呢？,第六节 致癌物质的测定,四、试验的步骤 1、将试验药品与鼠肝匀浆混合在一起保温一段时间 2、将试验菌株涂于基本培养基上 3、用圆形滤纸片吸入试验药品，然后将滤纸片放入上述平皿中央，进行培养 4、观察结果,第六节 致癌物质的测定,第六节 致癌物质的测定,第六节 致癌物质的测定,五、结果判定 1、如在平板上无大量菌落产生，说明试样中不含诱变剂 2、如在纸片周围有一抑菌圈，在其外才是大量的菌落，说明试样中某诱变剂的浓度很高 3、如在纸片周围即长大量菌落，说明诱变剂浓度合适,第六节 致癌物质的测定,一、营养缺陷型的筛选 1、与筛选营养缺陷型有关的三类培养基 （1）基本培养基（Minimal medium . MM) 用表示，仅能满足某微生物的野生型生长需要的最低成分的合成培养基。,第七节 突变型的筛选,（2）完全培养基（Complete medium . CM） 用+表示，凡可满足一切营养缺陷株营养需要的天然或半合成培养基，一般可在基本培养基中加入一些富含Aa、维生素和碱基之类的天然物质配制而成。,第七节 突变型的筛选,（3）补充培养基（Supplemental medium . SM） 用A表示，凡能满足相应的营养缺陷型生长需要的合成培养基，由基本培养基加入对某一微生物营养缺陷型所不能合成的代谢产物所构成。,第七节 突变型的筛选,2、与营养缺陷型突变有关的三类遗传型个体,第七节 突变型的筛选,（1）野生型（Wild type） 从自然界中分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，应该能在其相应的基本培养基上生长。,（2）营养缺陷型（auxotroph） 由于缺乏合成某些生长因素的能力而只能在CM和相应的补充培养基上生长而不能在MM中生长的变异菌株。,第七节 突变型的筛选,（3）原养型 （prototroph） 指营养缺陷型突变株经过回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。,第七节 突变型的筛选,3、营养缺陷型的筛选方法 一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节,第七节 突变型的筛选,（1）诱变剂的处理 （2）淘汰野生型（营养缺陷型的浓缩）,第七节 突变型的筛选,A. 青霉素浓缩法 1984年 B.Davis 和 J.Lederberg使用 该法分离到了营养缺陷型菌。,青霉素作用机制： 青霉素分子结构与细胞壁成分肽聚糖的五肽链的丙氨酰丙氨酸末端相似，青霉素与转肽酶反应形成青霉素酶的复合物，从而阻碍酶的转肽作用，最终导致干扰细胞壁的合成。青霉素只能杀死正在生长繁殖的细菌，对于停止分裂的细菌不起作用。,第七节 突变型的筛选,青霉素浓缩法的步骤： 细菌经诱变剂处理； 将处理过的细菌放在完全培养基中培养； 几小时后把细菌转入不含氮源物质的基本培养基中培养； 培养在含有无机氮源及青霉素的溶液中（几个样中的青霉素的量相同）； 几小时后，从各个样中取相同量的菌液分别涂在基本培养基和选择培养基上； 培养后观察菌数，取在基本培养基和完全培养基上菌落相差最大的进一步筛选营养缺陷型。,第七节 突变型的筛选,青霉素浓缩法的注意事项： A. 在用青霉素处理时，野生型细菌数不能过多； B. 青霉素的作用时间也不能过长 C. 对于酵母菌和霉菌，可以采用制霉菌素来代替青霉素,第七节 突变型的筛选,野生型的霉菌和放线菌的孢子在基本培养基上可以萌发并长出菌丝，但缺陷型的孢子则不会。 将诱变后的孢子悬浮液放在基本培养基上滤去菌丝则可浓缩缺陷型孢子。,第七节 突变型的筛选,B. 菌丝过滤法,第七节 突变型的筛选,C. 差别杀菌法,细菌的芽孢远比营养体更为耐热。 将诱变剂处理后的芽孢在基本培养基上培养一段时间，然后加热（如80，15min）即可浓缩缺陷型的芽孢。,第七节 突变型的筛选,D. 饥饿法,微生物的某些缺陷型菌株在某些条件下会自行死亡，可是如果在某一细胞中发生了另一营养缺陷型突变，这一细胞反而会避免死亡，从而可被浓缩。,（3）营养缺陷型的检出,第七节 突变型的筛选,A. 逐个测定法,把经过浓缩的缺陷型菌液接种到完全培养基上，待长出菌落后分别将每一个菌落接种到MM和CM上，在MM上不长而在CM上长的即是营养缺陷型。,第七节 突变型的筛选,B. 夹层培养法,先在培养皿上倒一层不含细菌的MM，冷凝后加一层含菌的MM，冷凝后再加一层不含菌的MM，经培养出现菌落后在培养皿底上把菌落作标记，然后加上一层CM，再经培养后出现菌落多的是营养缺陷型。,C. 限量补给法,第七节 突变型的筛选,将诱变后的细菌接种在含有微量补充养料的MM上，野生型迅速长成大菌落，缺陷型则较慢的长成小菌落。,第七节 突变型的筛选,D. 影印培养法,将经过诱变处理的细菌涂在CM的表面，待出现菌落后用灭菌丝绒将菌落影印接种到MM上，凡在CM上出现菌落而在MM上的同一位置上不出现菌落的即可初步判定为营养缺陷型。,（4）营养缺陷型的鉴定 可以采用生长谱法，将待测微生物（106108）混合在MM中倒入培养皿。待冷凝后，在标定的位置上放置少量Aa、碱基等结晶或粉末，经培养后在缺陷型所需要的化合物四周会出现浑浊的生长圈。,第七节 突变型的筛选,二、其它突变型的筛选 1、抗性突变株的筛选,第七节 突变型的筛选,（1）抗药性突变株的筛选,第七节 突变型的筛选,（2）结构类似物抗性突变株的筛选,为了增强菌体对于结构类似物的敏感性可采用如下方法：,改变培养基的碳源或氮源已减弱目的产物生物合成的代谢流； 添加目的产物生物合成途径中某反应的抑制剂； 添加抑制某种酶合成的物质； 设法增大结构类似物的细胞膜渗透性。,2、温度敏感突变株的筛选,第七节 突变型的筛选,可在诱变后将全部培养物放在低温下（细菌30、霉菌和酵母菌25 ）并以固体平皿分离，从该平板复制两个相同的检测平板，其一在上述条件培养，另一个在高温培养（细菌40、霉菌和酵母菌35 ），观察结果。,第七节 突变型的筛选,3、毒力降低突变株的筛选,利用毒素和抗毒素作用可以产生特异混浊圈的特性。,一、微生物育种的策略,第八节 微生物育种的策略及措施,微生物菌种选育或育种的目的： 要把出发菌株改造成能在特定条件下进行异常代谢，以实现从原料到目的产物的高效转化的高产菌株。,为了达到上述目的，可以采用五字策略：,第八节 微生物育种的策略及措施,“进、通、节、堵、出”,2、“通”：解除对途径中某些酶的反馈调节或者诱导或激活这些酶； G A B C D E F I H,第八节 微生物育种的策略及措施,1、“进”：促进细胞对碳源等营养物质的吸收；,3、“节”：阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，这里所说的阻塞是指消除或削弱以目的产物合成途径的起始底物或中间产物为起始底物的途径。,第八节 微生物育种的策略及措施,I K H A B C D E F M J,4、“堵”：消除或削弱目的产物的进一步代谢的途径。,第八节 微生物育种的策略及措施,A B C D E F M,5、“出”：促进目的产物向胞外空间分泌。,第八节 微生物育种的策略及措施,二、微生物育种的措施,第八节 微生物育种的策略及措施,1、切断支路代谢 主要依赖于营养缺陷型的应用。,谷氨酸棒杆菌的代谢调节及Lys 的生产,2、解除菌体自身的反馈调节,第八节 微生物育种的策略及措施,（1）选育抗类似物的突变株,概念：也称为代谢拮抗物抗性突变株，选育抗类似物的突变株是目前代谢控制发酵育种的主流。,优点：由于代谢调节可被遗传性的解除，在发酵时可不再受培养基成分的影响；抗类似物突变株不易发生回复突变。,菌株成为抗类似物的突变株的途径： 一是变构酶结构基因发生突变，是变构酶调节部位不再能与代谢拮抗物结合，而其活性中心却不变，即为抗反馈突变型。 二是调节基因发生突变，使阻遏物不能再与代谢拮抗物结合，即为抗阻遏突变型。,第八节 微生物育种的策略及措施,第八节 微生物育种的策略及措施,（2）酶特性的利用,在选育精氨酸产生菌时，通常要利用Arg生物合成酶系中乙酰鸟氨酸酶底物专一性宽的特性。乙酰鸟氨酸酶底物专一性差，也能以乙酰赖氨酸为底物，催化乙酰 Lys 转化成 Lys 。所以Lys可以通过乙酰Lys为底物生长，但是该酶受Arg阻遏，因而分离在Arg存在下形成的菌落（Lys+），就有可能是乙酰鸟氨酸酶的去阻遏突变株。,第八节 微生物育种的策略及措施,（3）营养缺陷型回复突变株的应用,当某一结构基因发生突变后，该结构基因所编码的酶就因结构的改变而失活，而经第二次突变（回复突变）后，该酶的活性中心结构可以复原。而调节基因部位的结构常常并没有恢复。结果是一方面酶恢复了活性，而另一方面反馈抑制却已解除或不怎么严重。因此，可以利用营养缺陷型的回复突变株来提高发酵产品的量。,当难于找到合适的类似物或多重性交叉难以增加抗性标记或反馈调节很复杂时可以考虑应用营养缺陷型回复突变株。,第八节 微生物育种的策略及措施,3、增加前体物的合成,（1）在分支合成途径中，切断除目的产物外的其它控制共用酶终产物分支合成途径，增多目的产物前体，使目的产物的产量提高,乳糖发酵短杆菌中Lys、Ala的生物合成途径及其调节,第八节 微生物育种的策略及措施,（2）目的产物的生物合成从别的终产物开始时，除设法解除目的产物自身合成的反馈调节外，也应设法解除对其前体物合成的调节。,用谷氨酸棒杆菌进行异亮氨酸发酵的机制,（3）利用基因工程技术，将生物合成途径中的关键酶基因克隆到多拷贝的载体上，使其大量扩增，从而也就增加了目的产物的前体物的合成，这是最直接提高目的产物产量的方法。,第八节 微生物育种的策略及措施,第八节 微生物育种的策略及措施,4、去除终产物,改变细胞膜的渗透性，把属反馈控制因子的终产物迅速不断的排出细胞外，不使终产物积累到起反馈调节的浓度，就可以预防反馈控制。,黄色短杆菌中Glu和Asp生物合成的调节机制,第八节 微生物育种的策略及措施,5、特殊调节机制的利用,（1）平衡合成的利用（Balanced synthesis）,第八节 微生物育种的策略及措施,（2）代谢互锁的作用,第八节 微生物育种的策略及措施,所谓代谢互锁（metabolic interlock）：就是从生物合成途径来看，似乎是受一种完全无关的终产物的控制，它只是在较高浓度下才发生，而且这种抑制（阻遏）作用是部分性的、不完全的。,第八节 微生物育种的策略及措施,第九节 突变与育种,一、自发突变与育种,1、从生产中选育 在日常的大生产过程中，微生物也会以一定频率发生自发突变，富于实际经验和善于细致观察的人们就可以及时抓住这类良机来选育优良的生产菌种。,2、定向培育优良品种 所谓定向培育一般是指用某一特定因素长期处理某微生物群体，同时不断的对它们进行移种传代，已达到积累并选择相应的自发突变株的目的。,丧失产芽孢能力的炭疽杆菌和卡介苗的选育都曾使用过该方法,二、诱变育种,诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株以供生产实践或科学实验之用。,1、诱变育种的基本环节或程序（以高产突变株为例）,（1）挑选优良的出发菌株（Original strain） 最好是经过生产中选育过的自发变异菌株； 采用最有利性状的菌株; 有时可考虑选择已发生其他变异的菌株; 在育种时可选择增变菌株的变异株; 在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时,最好考虑至少能积累少量所需产物或其前体的菌株; 而在选择产抗生素的出发菌株时,最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有一定程度提高的菌株。,2、诱变育种工作中应考虑的几个原则,（2）应处理单孢子（或单细胞）悬液,处理单孢子（或单细胞）悬液一方面可以使细胞分散，分散状态的细胞可以均匀的接触诱变剂；另一方面又可以避免长出不纯的菌落。,制备细胞悬液时应注意的事项： 同步培养，选择法和诱导法； 菌龄，细菌和酵母菌采用生长旺盛的对数期细胞，Fungi和Act采用单核的无性孢子，要求是刚刚成熟或刚刚萌发的； 细胞悬浮液浓度，真菌和酵母菌的孢子106ml，细菌的营养细胞和放线菌孢子108ml； 细胞悬浮液的制备，使用物理诱变剂时用生理盐水配制，使用化学诱变剂时要用缓冲液配制。,常用诱变剂的使用方法及注意事项:,（3）选择简便有效的诱变剂,紫外线: 在特制的诱变箱中进行。15w紫外灯，磁力搅拌器，紫外灯距搅拌器30cm。,a. 开启紫外灯，预热20min，使光波稳定； b. 将10ml细胞悬液置于灭过菌的并带有磁力搅拌棒的直径90mm的培养皿中放置在磁力搅拌器的载物台上，紫外照射10min，进行培养皿的表面消毒； c. 开启磁力搅拌器，打开皿盖，边照射边搅拌，并计时； d. 照射一定时间后，盖上皿盖，将培养皿取出，取1ml处理液稀释涂平皿或中间培养。,操作方法：,紫外线诱变的注意事项： a. 为了避免光复活作用，紫外线照射及照射后菌悬液的处理操作都必须在暗处或红光下进行； b. 紫外线诱变不受温度影响，可在室温下进行； c. 最好安装电源稳压器 d. 紫外线对皮肤和角膜有损伤作用，操作时应