解毒与活血配伍干预高脂血症与动脉粥样硬化的临床及机理研究.ppt

解毒与活血配伍干预 高脂血症与动脉粥样硬化 的临床及机理研究,张文高 吴 敏 刘美霞 刘龙涛 殷镜海 孟红艳 山东中医药大学及附属医院 中国中医科学院广安门医院、西苑医院 广州中医药大学，山东省立医院 2009-09-05,基金项目资助,高等学校博士学科点专项科研基金（No.20060441002） 中国博士后科学基金 （20070410622） 国家中医药管理局科技计划项目 （04-05LP30） 山东省中医管理局科技计划项目,研究背景与研究思路,高脂血症是动脉粥样硬化（As）主要的病理基础 As导致的心脑血管疾病是当今人类死亡的首位原因 As易损斑块（即“不稳定斑块”）的溃破、出血，随后血栓形成，是引起急性冠脉综合征（ACS）、急性脑梗死等心脑血管病急症的主要内因,研究背景与研究思路,如何调脂、抗As、抑制As斑块形成和稳定斑块，对于防治心脑血管疾病、改善其预后有着极重要的价值 多种活血化瘀药有调脂作用，活血化瘀防治As性疾病的疗效已得到公认 如何进一步提高活血化瘀药对于此类疾病的疗效、寻求更有效的中医药治法？值得我们深思。,研究背景与研究思路,Ross教授1999年提出的“As是一种炎症性疾病”已得到学术界共识。炎症介质在As斑块的起始、进展以及斑块的易损性（不稳定性）和最终破裂过程中，都起着重要作用。,研究背景与研究思路,将这一现代医学新进展联系中医药理论和临床，进行中西医结合创新性思考，我们认为单纯的活血化瘀对炎症病理环节作用显得不足，提出从毒邪致病理论对心血管病急重症中医病机与治则进行创新探讨的思路,研究背景与研究思路,7年前提出，不稳定型心绞痛作为心绞痛的特殊类型具有毒邪致病的特点，毒损心络为不稳定型心绞痛的重要病机，解毒为其重要治法； 5年前提出毒邪损心是充血性心力衰竭的重要病机，通过临床研究验证了益气活血解毒的疗效优势； 后来又提出“毒、瘀致易损斑块”和“解毒活血法稳定易损斑块”的假说。,研究背景与研究思路,相应提出清热解毒与活血化瘀配伍可望进一步提高对相关疾病的疗效。 沿着这一思路，进行了解毒与活血配伍，以及解毒与益气活血配伍，防治高脂血症、颈动脉粥样硬化、不稳定型心绞痛等临床研究和干预As斑块、稳定斑块相关的实验研究。,C57BL株系,Jackson 实验室,美国缅因州，世界上最重要的老鼠遗传学研究中心之一,1986-1989年培育出第一只基因敲除小鼠,ApoE基因敲除小鼠于1992年培育成功,基因敲除小鼠,ApoE基因敲除小鼠,美国科学家于1992年培育成功的载脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠，在正常饮食下即可形成明显的高脂血症及弥漫纤维增殖性As损伤病灶。成为研究As发病机理、干预措施、筛选抗As药物及机理研究较理想的动物模型。,研究背景与研究思路,本课题组从2000年开始，在国内外率先应用ApoE基因敲除小鼠开展心血管病中医、中西医结合基础研究，得到多项基金资助 山东省自然科学基金（Y2001C14） 国家自然科学基金（30472275） 山东省科技项目（200571-6） 高校博士点科研基金（20060441002）,研究背景与研究思路,进行血脂康、脂欣康、脉心康和多种单味活血化瘀、清热解毒中药以及多种解毒活血配伍药对对ApoE基因敲除小鼠降脂、抗As及稳定As易损斑块作用与机理研究，为中医药防治高脂血症、As及稳定易损斑块提供了科学依据，也为解毒与活血配伍抗As研究奠定了基础。,研究背景与研究思路,在此实验研究基础上，结合长期临床经验，重点研究了若干解毒与活血配伍的创新药对: 虎杖与山楂配伍 大黄与红曲配伍 虎杖与芎芍胶囊配伍,虎杖与山楂,虎杖具有解毒消肿、利湿等功效 山楂擅长活血行滞而消积 两者配伍不仅有前期实验论证的基础，而且已经应用于临床科研，疗效显著。,虎杖与山楂,虎杖,解毒消肿,利 湿,虎杖苷,抗炎作用,保护血管内皮,抑制血小板聚集,抑制内皮细胞增殖,抑制血管平滑肌细胞增殖,抗 As,山楂,活血行滞,消 积,山楂提取物,调节血脂作用,抗氧化作用,降压作用,抑制血小板聚集,为了深入研究解毒（虎杖）与活血（山楂）配伍的调脂、抗As、稳定斑块作用及其作用机制 临床研究高脂血症 颈动脉粥样硬化斑块 实验研究ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞源性泡沫细胞试验,第一部分 解毒与活血配伍干预高脂血症与动脉粥样硬化的临床研究,一、解毒与活血配伍（虎杖山楂配伍）治疗中老年高脂血症合并脂肪肝的临床研究 二、解毒与活血配伍（虎杖山楂配伍）对颈动脉粥样硬化斑块及其稳定性干预作用研究,一、解毒与活血配伍（虎杖山楂配伍）治疗中老年高脂血症合并脂肪肝的临床研究,研究方法与内容,参照血脂异常防治建议标准、非酒精性脂肪性肝病诊断标准及腹部疾病超声诊断制定。,本研究纳入病例来自济南市机床二厂集团职工及家属。,符合上述高脂血症及脂肪肝诊断标准者。年龄在4069岁之间者。,诊断标准,病例来源,纳入标准,空白对照组 20例,山楂虎杖配伍组 （活血解毒配伍组）,虎杖组（解毒组） 20例,山楂组（活血组） 20例,洛伐他汀组 20例,分 组 及 治 疗 方 法,山楂提取物,虎杖提取物,山楂提取物及 虎杖提取物,洛伐他汀,不给予药物,20例,A,B,C,D,E,空白组,山楂组,观察项目,安全性观察,疗效性观察,临床症状总疗效,对血脂的影响,降脂疗效,对肝功能的影响,对脂肪肝超声声像分度改善疗效,对炎症因子的影响,结 论,解毒活血配伍（虎杖山楂配伍）方案治疗高脂血症合并脂肪肝疗效可靠， 优于单纯解毒（虎杖）或活血（山楂）， 其作用机制与降脂、抗炎和保肝等有关。,二、解毒与活血配伍（虎杖山楂配伍）对颈动脉粥样硬化斑块及其稳定性干预作用研究,颈动脉粥样硬化斑块检测意义,颈动脉粥样硬化的病变程度与心脑血管疾病的发生有直接的相关性 通过观察颈动脉粥样硬化程度，可客观地估计以As为病理基础的心脑血管疾病的发病危险性及治疗效果,颈动脉粥样硬化及斑块的诊断,颈动脉内中膜厚度（IMT） 是指动脉内膜和中膜平滑肌的厚度，即由管腔内膜面的前缘到中膜平滑肌与外膜交界面前缘的垂直距离。,稳定性斑块,扁平斑,硬斑,软斑,溃疡斑,不稳定性斑块,解毒组（虎杖提取物组， A组） 活血组（山楂提取物组 ，B组） 解毒活血配伍组（虎杖提取物与山楂提取物配伍组， C组） 洛伐他汀对照组（D组） 空白对照组（E组） 各30例，疗程6个月,各组病例治疗后临床症状总疗效比较,各组病例治疗前后中医症状积分比较,*,*,*,*,颈动脉粥样硬化斑块超声检测指标比较,*,*,#,#,#,#,#,#,#,#,#,*,*,颈动脉粥样硬化斑块超声检测指标比较,*,#,#,#,*,颈动脉粥样硬化斑块超声检测指标比较,颈动脉粥样硬化斑块超声检测指标比较,*,*,颈动脉血流动力学检测比较,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,颈动脉血流动力学检测比较,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,斑块稳定性血清指标检测,*,*,*,*,斑块稳定性血清指标检测,*,*,*,*,#,#,#,*,*,斑块稳定性血清指标检测,第二部分 研究结果,斑块稳定性血清指标检测,#,*,*,血压水平比较,*,*,*,*,血脂水平比较,*,*,*,*,小 结,解毒与活血配伍 显著改善患者症状 显著减小颈动脉IMT、IMTarea、MIMT、斑块积分，增大管腔内径，缓解管腔狭窄程度，改善颈动脉斑块超声病理分型及颈动脉血流动力学 具有调脂、降压、抗炎（降低hs-CRP、sICAM-1、sVCAM-1）、减少细胞外基质降解（降低MMP-1及MMP-1/TIMP-1比值）等作用,小 结,解毒与活血配伍具有抗动脉粥样硬化、稳定斑块的作用 解毒与活血配伍疗效优于单纯解毒组、活血组及洛伐他汀组,第二部分 解毒与活血配伍干预 载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉 粥样硬化泡沫化细胞形成机制研究,一、解毒与活血配伍（虎杖山楂配伍）干预载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化泡沫化细胞形成的炎症机制研究 二、从PPAR、ABCA1、CD36途径探讨解毒活血中药配伍干预载脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞的分子机制,ApoE基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞较普通小鼠更容易摄取ox-LDL而形成泡沫细胞，是进行体外培养巨噬细胞源性泡沫细胞研究的理想选择。 单核巨噬细胞经外源性致炎物质脂多糖（LPS）激活，摄取ox-LDL，并吞噬大量脂质形成泡沫细胞，是早期As的标志。,一、解毒与活血配伍（虎杖山楂配伍） 干预载脂蛋白E基因敲除小鼠 动脉粥样硬化泡沫化细胞形成 的炎症机制研究,ApoE（-/-）小鼠,腹腔巨噬细胞培养,分为B-G组与ox-LDL+LPS 共孵育，并分别加药干预,B 虎 杖 苷,C 山 楂 提 取 物,D 虎杖 苷山 楂提 取物 组,E 洛 伐 他 汀 组,F 罗 格 列 酮 组,G 模 型 组,A 空 白 对 照,分别观察0、24、48h 三个不同时相的 以下指标变化,Western blot,ELISA,TLR4 NF-B,TNF- IL-1,数据整理、统计分析,技 术 路 线,这部分工作明天上午将由 刘美霞、刘龙涛博士汇报,IL-1含量,TNF-含量,NF-B蛋白表达,TLR4蛋白表达,结 论,解毒活血中药配伍能显著减少ox-LDL、LPS诱导的ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞源性泡沫细胞内TLR4的表达， 抑制NF-B的激活， 进而减弱TLR4/NF-B信号途径及IL-1、TNF的合成与释放， 抑制炎症反应，干预巨噬细胞泡沫化，延缓As的发生与发展； 解毒活血配伍的上述作用优于罗格列酮，也优于单纯解毒或活血。,二、从PPAR、ABCA1、CD36途径 探讨解毒活血中药配伍 干预载脂蛋白E基因敲除小鼠 巨噬细胞源性泡沫细胞的分子机制,PPAR、 CD36与ABCA1,过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）调控体系是目前As研究中的热点之一。PPAR属于核受体超家族中PPARs家族的成员，是配体依赖性的转录因子，在调节脂质代谢、脂肪细胞分化和能量代谢中起关键性作用。,PPAR、 CD36与ABCA1,B类清道夫受体CD36、三磷酸腺苷结合盒转运子A1 (ABCA1)都是PPAR转录调控的下游靶基因。 PPAR配体调控网络已被证实具有抗As作用。近年研究表明PPAR可通过其活化后对下游靶基因CD36、ABCA1转录水平调控及相关细胞因子的释放来影响As泡沫细胞的形成。,研究方法,ApoE（-/-）小鼠,腹腔巨噬细胞培养,分为B-G组与 ox-LDL+LPS 共孵育，并 分别加药干预,B 虎 杖 苷,C 山 楂 提 取 物,D 虎杖 苷山 楂提 取物,E 洛 伐 他 汀,F 罗 格 列 酮,G 模 型 组,A 空 白 对 照,分别观察0、24、48h 三个不同时相的以下 指标变化,RT-PCR,PPAR CD36 ABCA1,数据整理 统计分析,PPAR上游引物为5-CCC TGG CAA AGC ATT TGT AT -3， 下游引物为5-AAT CCT TGG CCC TCT GAG AT-3（403bp）； ABCA1上游引物为5-CAG ATG CCC TAC CCC TGT TA-3， 下游引物为5- GGG AGA AGA GCG TGC TAA TG-3（364bp）； CD36 上游引物为5-CCT TAA AGG AAT CCC CGT GT -3，下游引物为5-CCA ATG GTC CCA GTC TCA TT-3（418bp）； -actin上游引物为5- TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA -3，下游引物为5- TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG -3（302bp）。,各引物序列,细胞总RNA提取及RT-PCR反应均采用RT-PCR检测细胞因子试剂盒（购自上海生工生物工程技术有限公司）。 收集107细胞沉淀提取细胞总RNA，取1ug逆转录成cDNA，进行PCR扩增（所有操作均严格按照试剂盒说明书进行）。,RNA提取和RT-PCR反应,扩增条件 94度1分钟，58度1分钟，72度 1分钟，共35个循环，最后72度延长7分钟。 取各基因扩增产物10ul，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，多功能紫外投射反射分析仪下观察并拍照，采用美国Kodak凝胶分析系统，应用1 D Image Analysis Software进行产物灰度图像分析，以各基因与-actin的电泳条带光密度值的比值作为各基因的相对表达量。,研究结果1,解毒活血中药配伍对ApoE(-/-)小鼠巨噬细胞PPARmRNA表达的影响,研究结果 1,解毒活血中药配伍对ApoE(-/-)小鼠巨噬细胞PPARmRNA表达的影响,#,#,#,#,与模型组比较,与解毒活血配伍组比较,研究结果2,解毒活血中药配伍对ApoE(-/-)小鼠巨噬细胞ABCA1mRNA表达的影响,研究结果2,解毒活血中药配伍对ApoE(-/-)小鼠巨噬细胞ABCA1mRNA表达的影响,#,#,#,与解毒活血配伍组比较,与模型组比较,#,研究结果3,解毒活血中药配伍对ApoE(-/-)小鼠巨噬细胞CD36mRNA表达的影响,研究结果3,解毒活血中药配伍对ApoE(-/-)小鼠巨噬细胞CD36mRNA表达的影响,#,#,#,#,与解毒活血配伍组比较,#,小 结,用ox-LDL、LPS刺激ApoE(-/-)小鼠腹腔巨噬细胞，可以诱导泡沫细胞的形成， 细胞内PPAR、ABCA1、CD36的mRNA表达均显著增高。,小 结,与模型组比较， 以洛伐他汀、罗格列酮作为对照， 以解毒中药虎杖、活血中药山楂及其配伍作为主要研究药物进行干预48h后， 各用药组PPAR、ABCA1的mRNA表达均显著增高， 各用药组CD36mRNA的表达显著降低， 解毒活血配伍组优于单纯解毒组、活血组及洛伐他汀组，相当于或优于罗格列酮组。,研究提示,解毒活血中药配伍具有与罗格列酮相似的PPAR激动作用， 可能通过激活PPAR，从转录水平调节下游靶基因CD36、ABCA1及炎症因子的表达， 干预ox-LDL-PPAR-CD36与ox-LDL-PPAR-ABCA1两条信号通路，使ABCA1mRNA表达上调、CD36mRNA表达下调， 从而起到显著抑制巨噬细胞泡沫化过程，最终达到抗As的作用。 解毒活血中药配伍有望成为中医药领域抗As泡沫细胞形成的新型药