免疫组织化学染色技术.ppt

免疫组织化学染色技术,第一节 常规组织学染色技术概述,宏观 微观 超微结构 基因水平 组织形态学研究技术的种类： 一、病理大体组织标本的染色方法 在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特点，如： 脂肪组织染色法 目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样硬化大体标本的染色,试剂：苏丹或苏丹 结果：病变处脂肪组织呈橙黄色 早期心肌梗死染色法 目的：显示早期心肌梗死的区域 试剂：0.1% NBT(硝基四唑蓝) / 0.2 mol / L PBS (pH 7.6) 方法：将2-3 mm 厚新鲜心肌大片放入试剂中，37 C 孵育20 min。 结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔 组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。 注意 ：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。,二、光学显微镜下的组织学染色方法 常规HE染色（hematoxylin and eosin staining） 组织学特殊染色 1. Mallory 三染色、Masson三染色 2. 神经纤维的镀银染色 3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、细胞DNA和RNA的染色等 上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形态改变。 三、超微结构的观察 光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2m 有效放大倍数最高不超过2000倍。 电镜的分辨率最佳可达0.14nm，放大倍率最高可达100万倍。,第二节 免疫组织化学染色技术 Immunohistochemical technique 该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫细胞化学技术。 根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为： 1. 免疫酶细胞化学技术 2. 免疫荧光细胞化学技术 3. 免疫铁蛋白技术 4. 免疫金-银细胞化学技术 5. 免疫电子显微镜技术,一、免疫组织化学染色方法的原理 抗原（antigen） 1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。抗原具有两种性能： （1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。 （2）反应原性（reactogenicity）指抗原分子与抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反应的特性。,2. 抗原的分类 完全抗原、半抗原 免疫学分类 胸腺依赖抗原与非依赖抗原 外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿 瘤相关抗原等 临 床 分 类 同种异型抗原：人类白细胞抗原、 血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物 等之间存在的共同抗原,抗体（antibody） 1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。 大部分抗体电泳后位于区带，1972年国际免疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。 2. 抗体的种类: 五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM 免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是IgG，个别情况下使用IgG的亚型，多为IgG1。,免疫组织化学染色的反应原理及显色原理 1. 免疫组织化学染色的反应原理 染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。 通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗原是否存在。 通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在与否。,2. 免疫组织化学染色的显色原理 (1) 基本原理 荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其中以酶标抗体法应用最为广泛。 直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色，显示出所检测的目的抗原的部位。 间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。 间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠制备的单克隆抗体。, 第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量，可提高免疫组织化学染色的敏感度。 IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。 （2）显色的基本程序 1抗孵育切片或细胞涂片 2抗（酶标抗体）孵育切片 发色剂显色 （核复染）,（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） HRP + H2O2 HRP H2O2 HRP H2O2 + DH2 HRP + D + 2H2O HRP催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使反应的终产物呈现不同的颜色，如： CN为蓝色 TMB为深蓝色 AEC为红色 DAB为棕色,碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 以AS-Mx（色酚AS-MX磷酸盐）为底物，FB/FR (Fast blue/Fast red)为发色剂，生成蓝色 / 红色不容性沉淀物。 ALP标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。 由于组织细胞内含有内源性ALP，在显色液中需加入终浓度为2-4mol/L的左旋咪唑 (levamisole)，大多数内源性ALP活性可被抑制。 葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase，GOD ) 以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为-D-葡萄糖67mg、NBT 6.7mg、 PMS(吩嗪硫酸甲酯,phenazine methyl-sulfate) 0.167mg、0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml，37C孵育1小时，生成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片可经脱水、透明后封片，长期保存。,（4）核复染 在显色后，特别是用DAB显色后，切片可用苏木素染料进行核复染，经水化后细胞核显示蓝色，与胞质中的DAB棕色形成对比。但用AEC显色后不能用苏木素做核复染，因为配制苏木素染料中使用酒精作为介质，可使AEC的红色终产物褪色，且AEC显色后只能用水溶性封固剂封片。,第三节 免疫组织化学染色步骤,（一）ABC或SP法进行石蜡切片染色的主要步骤 1. 组织材料的采取； 2. 组织块的固定； 3. 组织块的脱水、透明及石蜡包埋； 4. 石蜡切片的制备； 5. 石蜡切片的脱蜡及水化； 6. 抑制内源性过氧化物酶活性； 7. PBS洗涤切片； 8. 抗原修复或蛋白酶消化切片，修复或暴露抗原； 9. PBS洗涤切片；,10.用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清（或同时 加入BSA）孵育切片，防止抗体的非特异性吸附； 11. 用特异性一抗(单克隆、多克隆)孵育切片； 12. PBS（可加入Tween 20#，PBST）洗涤切片； 13. 用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片； 14. 用PBS或PBST洗涤切片； 15. 滴加SP试剂或ABC试剂； 16. PBS或PBST洗涤切片； 17. DAB或AEC显色； 18. 自来水洗涤切片，终止显色； 19. 用苏木素做核复染； 20. 切片脱水、透明，树胶封片。,（二）各染色步骤的具体操作及注意事项,1. 组织材料的采取 活检组织 组织标本 手术切除标本 尸检标本 实验组织或培养细胞 活检组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内窥镜钳取的组织 体积小，因活检钳直接钳取，常受压过度而变性，因此， 活检钳的刃口必须锐利，以免组织受压，活检时应采取主要的病灶区。 抗原在组织中的分布不均一，故病灶较大的切除标本应考虑切取主要病灶。病灶与正常组织交界区及远距病灶的正常区。, 尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同程度自溶，其抗原或变性消失或有严重的弥散现象。法医尸检一般多在24小时以上，甚至数月后，检材受死后变化影响严重，而影响染色结果。手术切除的组织较新鲜，取材后应立即固定，以保存组织结构和抗原。 实验动物标本 新鲜，可按需要取材；很多情况下是在灌流固定后取材，组织结构和抗原保持良好，非常适用于免疫组织化学染色。 取材标本的大小 尸检组织材料大小以1cm1cm 0.2cm 为宜。实验动物常用大鼠或小鼠，其脏器体积小，有利于取材。一般标本体积不宜过大，防止固定不透，影响抗原的保存，也浪费试剂。,2. 组织块的固定、水洗 （1）固定液：种类较多，常用的有以下2种： 4% 甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法： 10 ml 40% 甲醛 (formalin) + 90ml PBS 使用新鲜甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛)，还可形成甲酸，影响染色结果。(可以用粉笔溶) 4% 多聚甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法：40g多聚甲醛(paraformaldehyde)+500 ml 0.1 mol/L PB (pH 7.2-7.4)，搅拌、加热至60 C，同时滴入1N NaOH 至溶液完全透明。冷却后用1N HCl 调PH 值至7.2-7.4，再用0.1mol/L PB将溶液加至1000ml。 固定时间：一般根据组织块大小及性质，固定2-24小时。 固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。 甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应，并能保存脂类和类脂体。 不利作用：甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的 抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体的结合。,（2）水洗 冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定时 间长短有关。尸检组织和大动物组织一般冲洗24 小时，小动物组织冲洗2-10小时。 新鲜标本固定时间短，冲洗时间也相应缩短，固 定时间长的标本，冲洗时间也需延长。 冲洗时组织放在广口瓶中，瓶口用纱布罩好并扎 紧，防止组织块漏出。用一根适当的胶管，一端 接自来水，一端插入瓶底，使水缓慢流出，或将 组织块放入洗涤筐中，放在水盆内冲洗。 对于过小组织或穿刺组织和小动物组织多次换水 浸泡即可。,3. 组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋 （1）脱水 脱水剂：酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇，最常用酒精。 酒精可以与水以任何比例混合，脱水能力强，并可硬化组织。酒精对组织的穿透速度很快，对组织有较明显的收缩作用。为避免组织过度收缩，应从低浓度开始，然后再依次增加其浓度。在常温下或4 C下进行，以减少抗原的损失。 70% 80% 90% 95% 100% 100%,（2）透明 为使石蜡能浸入组织块，组织经脱水后，必须经过一种既能与酒精相溶，又能溶解与石蜡的溶剂。通过溶剂的媒介作用而达到石蜡浸入组织块的目的。 透明剂：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用 二甲苯。 一般经过23次纯二甲苯溶液透明，每次10 15分钟，同时应根据组织的种类和组织块大小以及二甲苯的新鲜程度加以调整，不应机械照搬。,（3）浸蜡 组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。 为使石蜡充分渗入组织只，常需经过2-3次石蜡浸渍。 用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温蜡，在60 C以下浸透。 （4）包埋 浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡到入包埋盒，冷却后取出，修块。,4. 石蜡切片的制作 （1）载玻片涂片的制作 防脱片剂：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxy silane, APES）、多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）、甲醛-甘油明胶。 APES 涂片的制作 原理：APES是一种新型玻片粘附剂，与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，不易脱落，保留时间较久。 具体操作方法： 将载玻片用酸处理后，用95%酒精浸泡，再用绸布擦干，清除表面的污渍；, 将干净的载玻片放入丙酮内5min； 将载玻片用镊子夹住浸入APES试剂（1ml APES+50ml丙酮）1-2次； 纯丙酮内洗2次后，37 C过夜，干燥； 用铝箔包好，室温下存放，可存放半年。 多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，PLL） 试剂配制：PLL 0.5g + 蒸馏水 100 ml 也可根据提供的方法配制。可于4 C或- 20 C 保存备用，可反复冻存，效果无明显影响。 涂片前将其稀释10-50倍，均匀涂在处理后干净的载玻 片上，37 C下干燥过夜。,甲醛-甘油明胶 试剂：40%甲醛 2.5ml，明胶0.5g，蒸馏水加至100ml。 配制方法：用一部分蒸馏水（约80ml）加热溶解明 胶，待完全溶化后加入甲醛，最后补充蒸馏水至 100ml，混匀即可。 粘附切片的效果较上述两种方法差，特别是切片经抗原热修复或酶消化后，有时易脱片。 （2）制做切片 切片机：旋转式或滑动式切片机。 切片厚度：5-7m。 展片：切片放入玻璃平皿中的温水中展 开切片（水浴锅上加热平皿）。 捞片：用涂有防脱片剂的载玻片捞取切片。 切片干燥： 37 C过夜，干燥。,5石蜡切片的脱腊及水化 脱蜡：将切片放入染色筐中，二甲苯 、 各15分钟脱腊， 水化：100%酒精、中各10分钟、95% ALC 5分钟、90% ALC 5分钟、80% ALC 5分钟、70% ALC 5分钟，蒸馏水浸洗。 6清除内源性过氧化物酶活性 由于常规免疫组织化学染色的最后显色是用辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和DAB (3, 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)，而组织中常含有内源性过氧化物酶，为防止出现假阳性反应和减少背景染色，需要先清除内源性过氧化物酶活性。,染 色 框, 具体方法：将切片置入甲醇(PBS)-H2O2 液中2030分钟 试剂：纯甲醇 99 ml 30%，H2O2 1ml 充分混匀，使最后浓 度为0.3%，或0.01ml PBS (pH 7.27.4) 99ml 30% H2O2 1ml 7PBS洗涤切片 经甲醇- H2O2或PBS-H2O2 处理后的切片先用蒸馏水洗一次5min，再用PBS洗5min3次。 0.01mol/L PBS (pH7.27.4) 的配制： NaH2PO4 2H2O 0.45 g Na2HPO4 12H2O 3.23g NaCl 8.0g 蒸馏水 加至1000 ml 为防止抗体与组织发生静电吸附而产生非特异性染色，可在PBS中加入Tween 20#，制成含0.1% Tween 20# 的PBS。Tween 20# 为一种除污剂，可清除和封闭组织中的静电荷。,8抗原修复（antigen retrieval, AR） 某些抗原的免疫组化染色不需要此步骤即可染色，如横纹肌中的myoglobin (Mb)、actin、myosin、脑组织中的S-100蛋白、GFAP、血型抗原A、B、H、生长激素(growth hormone)、胰岛素、波形蛋白(vimentin)、降钙素(calcitonin)等。但有一部分抗原物质或检测的因子等由于组织经甲醛固定后，因蛋白质的交联，将抗原封闭或发生变性，因此需要热修复或蛋白酶消化。 目前机理清楚，但是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复处理经验表明，可以提高抗原抗体阳性检测率，同时也会出现假阳性，现已广泛用于技术中。尤其对原来仅表达在冰冻切片上的抗原，利用后大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上。,（1）抗原热修复 方 法 微波中 96 1020 min 直接加热法 100 10 min 高压锅 / 消毒锅 120 10 min 其他：水浴锅 100 10 min2 及真空加热 10 min 等。 热修复的介质 0.01 mol/L pH 6.0 柠檬酸缓冲液 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH 112) 0.01 mol/L pH 7.0 PBS 2 % 硫酸铝 2 % 硝酸铅 生理盐水 蒸馏水,溶液的摩尔浓度对修复效果无任何影响，而pH值则影响较大，缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液较常用。,温度与修复时间的关系： 许多的实验结果表明：温度高修复时间短，如Ki-67和P-gp的检测，利用同一切片，达到相同染色结果需要： 100 20min； 90 30min； 80 50min； 70 20h 操作流程 微波处理：将切片插入25 片塑料架上，在250 ml塑盒内加入200 ml缓冲液，将微波高档加温缓冲液至90+，取出后自然冷却至室温后蒸馏水洗，PBS洗。 水浴锅法：一种传统的抗原修复方法，首先调节水温达 95左右，将切片置入内含200ml缓冲液的塑料盒或烧杯内，放入水浴锅，温度平衡后开始计算时间20 min，取出容器后自然冷却到室温。 压力锅法：不锈钢高压锅内加入一定量的缓冲液，加热锅使液体煮沸，将切片加入切片架并置入锅内，盖上锅盖，不加阀，开始冒气计时50 min，关闭气阀，使之加压10 min。再将压力锅置于流水槽中冲洗10 min，冷却后取出切片，PBS洗。, 最佳修复方法的选择 选择最佳的修复方法设计表 柠檬酸 Buffer pH 12 pH 6 pH 10-11 Tris-HCl Buffer pH 12 pH 7-8 pH 10-11 微波100 10min2 slide 1 slide 2 slide 3 压力锅120 10min slide 4 slide 5 slide 6 微波或水浴90 30min slide 7 slide 8 slide 9 slide 10 作对照，不作任何处理, 抗原热修复应注意的问题 有些抗体在石蜡或冰冻切片上呈阴性反应，但石蜡切片用抗原修复后却能很好显示，对某些应表达在胞浆或膜上的抗原，经修复后，绝大部分表达在核内。而有些表达在核内的抗原经修复后会出现在胞浆内，因此，在使用该方法时一定要小心，对结果的判定也要做出客观的分析，同时在操作过程中还注意以下问题：, 热处理后应自然冷却切片。 不能煮干修复液。 不要任何抗原的检测都使用该方法。 一批抗原的检测其温度和时间应保持一致。 一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，但对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染现象。 如果在常用的缓冲（修复）液中无法实现抗原修复，得不出好的染色结果，或经修复后，抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液或加一些鳌合剂，如EDTA或EGTA等可能取得较好的效果。,（2）蛋白酶消化法 原 理：蛋白酶消化可以去除覆盖在抗原决定簇表面的杂蛋白，更为重要的是因甲醛固定而引起的交联被酶消化打开而引起暴露抗原决定簇的作用，使第一抗体能与抗原部分结合，提高阳性检测率。 注意事项：用于IHC切片消化的酶有多种，所选择酶的种类、使用的浓度、pH值、消化时间及温度等均要视组织固定的不同、所检测抗原的性质、组织类型的不同而异，通过预实验确定。, 常用的消化酶类： 胰蛋白酶和蛋白酶K：检测细胞内抗原切片的消化，如 Keratin、CEA、GFAP等。 胃蛋白酶：细胞间质抗原检测切片的消化，如纤连蛋白 (fibronectin)，各型胶原等。 消化时间及温度：一般消化时间与组织固定的长短呈正比。蛋白酶的消化时间51020min，视切片固定时间的长短而定。,（3）酶消化液的配制 除了商业销售的成品，可按说明书使用外，还可自行配制。 0.1% 胰蛋白酶 胰蛋白酶 0.1g 0.1% 氯化钙 (pH 7.8) 100 ml 配制方法：先配制0.1%的CaCl2，用0.1mol/L 的NaOH将其pH调至7.8，然后加入胰蛋白酶0.1g，溶解之。用前将胰蛋白酶液过滤，并在水浴中预热至37，室温下消化时间530min，多用于细胞内抗原的暴露。, 0.4 % 胃蛋白酶 胃蛋白酶 400 mg 0.1N HCl 100 ml 多用于间质组织免疫组化染色切片的消化， 37下消化时间约30 min。 0.06 % 蛋白酶K 蛋白酶K 0.06 g 0.05mol/L Tris-HCl (PH7.5) 100 ml 用法同上。 在免疫组化染色中，有时经过度固定的标本，影响一抗与抗原的结合，用蛋白酶溶液消化，起到暴露抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异。总之，在保持组织形态不破坏的前提下，宜尽量消化时间延长。以上三种酶消化液，以第一种最为常用。,9. 经热修复抗原或蛋白酶消化的切片经洗涤后进行下一步。 10. 用与制备二抗相同的动物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特异性吸附。 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色。 最常见的原因是蛋白 (第一抗体) 吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。 最有效的方法是在用第一抗体孵育切片前，用与制备第二抗体相同动物的非免疫血清封闭组织上带电荷基团，而除去与第一抗体的非特异性结合 (在室温下进行)。 非免疫血清的稀释度1:51:20，还可加入BSA (bovine serum albumin) 使稀释后的非免疫血清中含0.16%的BSA，可取得更佳的染色效果，阻止非特异性背景染色。该方法是减少非特异性背景染色的有效方法。,11用特异性一抗孵育切片 研究组织细胞中的某种抗原是否存在，应用免疫组化染色，就要选用针对这种抗原的特异性抗体。现在国际上有许多公司生产免疫组化试剂，包括一抗、二抗、显色剂，并制成了成套的试剂盒，但一般试剂盒中不包括一抗，研究者可根据一抗的种属性，选择含有与一抗相匹配的二抗的试剂盒。 一抗的种属来源 一抗可来源于各种种属的动物，常见是来自家兔、山羊或小鼠，偶见来自马。一般来自家兔和山羊的一抗都是多克隆的IgG抗体，而来自小鼠的多是单克隆的IgG抗体。根据实验动物或标本种属的不同，选择针对大鼠、小鼠或人的抗体。, 抗体剂型及滴度检验 我国现在使用的多数抗体等试剂是由国外进口，包括一抗和含二抗的试剂盒。 国外生产的一抗一般浓度都是100-200g/ml，但国内各经销商将进口的原装抗体又进行了分装，如分成0.1-0.2ml/瓶等，也经销1ml/瓶抗体，价格各不相同。 国内各经销商又根据需要将进口抗体进行稀释，销售的品种又分为即用型和浓缩型(进口原装的抗体)两种。 在免疫组化染色中，使用即用型一抗和试剂盒一般不需稀释，直接在切片上滴加即可。 浓缩型必须在稀释后才能使用，因为浓缩型抗体浓度高，可引起严重的非特异性染色，因此，必须在正式染色前先用切片对不同滴度的抗体染色效果进行评价，选择浓度强度最好，非特异性反应（背景染色）最低的抗体稀释度来进行正式染色。,一抗稀释滴度的评价 （摸索实验条件时可以稀释度跨度大一些试） 切片编号 slide 1 slide 2 slide 3 slide 4 slide 5 抗体稀释度 1: 50 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 特异性染色 + + + + + + + + + + + + + + + 背景染色 + + + + + , 一抗体的稀释 一般稀释一抗的液体与洗涤切片的液体相同，即0.01mol/L PBS pH 7.2-7.4，为进一步保证减少背景染色，用于稀释一抗的PBS中也应加入制备二抗的同种动物的非免疫正常血清，有条件的还可加入BSA，两者的浓度在1-2-5% 即可。 一抗的孵育时间及条件 加入适当稀释的一抗的切片，可在常温下或37下保温盒内孵育。经过正常二抗同种动物非免疫血清孵育后的切片不能用PBS洗涤，在去除多余的非免疫血清后，直接向切片上滴加稀释好的第一抗体。孵育时间：30-60分钟或更长。 如果待检的抗原量很少，而增加一抗的浓度又能引起较明显的背景染色，可增加一抗的稀释倍数，将切片放在保湿盒中置于4冰箱内过夜孵育，可达到满意的效果。,12PBS洗涤切片 将用一抗孵育后的切片用PBST洗涤3次，每次5min，用冷PBS洗涤，可减少非特异性反应。 13用针对一抗的生物素化二抗孵育切片 根据一抗的种属来源，选择相应的二抗。如：一抗是家兔抗某种抗原抗体，二抗一般选用山羊抗家兔IgG抗体。二抗分浓缩型和即用型两种。即用型二抗不需稀释，直接使用。浓缩型者一般用PBS直接以1: 200- 400倍稀释使用，室温下保湿盒内孵育30-60min。 试剂盒：浓缩型或即用型 SP试剂盒、ABC试剂盒 试剂盒中包含：内源性过氧化物酶阻断剂 二抗的同种动物非免疫血清 生物素标记的抗IgG抗体（二抗） SP试剂 ABC试剂（单独购买）,14PBS洗涤切片5min3次 15滴加SP试剂或ABC试剂 （1）生物素-抗生物素染色（SABC或SP法）的显色原理 ABC法的染色原理 很早以前研究者就注意到给动物饲以大量的鸡蛋白，会引起明显的“维生素H 缺乏症”，也称为“蛋白质伤害”。经研究发现，在鸡蛋白中含有一种碱性蛋白，分子量为68 kD，属于糖蛋白，当时命名为卵白素（avidin）。机体中还有一种物质叫维生素H，又称为生物素（biotin），是一种小分子的维生素，广泛分布于动植物组织中，以辅酶的形式参与各种羟化酶反应，分子量为244 D。,卵白素具有4个同Vitamin H（生物素）亲和力极高的结合点。给动物饲以大量的鸡蛋白所致的维生素H缺乏，就是由于卵白素和大量维生素H结合所致。研究者根据这两种物质的特点，提出了卵白素-生物素免疫染色系统。由于习惯上将维生素H称为生物素，为便于理解，我国免疫细胞化学作者将卵白素称为抗生物素或亲和素，因此卵白素-生物素免疫染色系统又称为抗生物素-生物素免疫染色法。 生物素的另一特点是它可以和抗体IgG的Fc段结合，不影响IgG的活性。同时，生物素经活化后还可同过氧化物酶或ALP等结合，而不影响酶的活性。根据上述这些抗生物素-生物素的反应原理和特性，1981年许世明设计出了免疫组织化学染色的ABC法（avidin-biotin peroxidase complex method， ABC ），并已制成了商品化的试剂盒。,ABC法免疫组化的试剂盒中除包括制备二抗的同一种属动物的非免疫血清、生物素标记的二抗外，还包括：A试剂 (抗生物素) 和B试剂 (生物素-过氧化物酶复合物)。在使用前半小时，将两种试剂按说明书要求相互混合，形成复合物，一般是在5ml 的PBS中加一滴A试剂 (约50l)，混匀后再加一滴B试剂 (约50l)，混匀，半小时后加至经过生物素标记的二抗孵育的切片上，室温下保湿盒内孵育30-60 分钟。 SP 法的染色原理 基本原理与ABC法相似，但与ABC法稍有不同，是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。,P-O,Antigen,Biotin,Avidin,HRP,Illustration of ABC method,Biotin,Streptavidin,Enzyme: HRP or AP,Illustration of SP method, SABC 法的染色原理及特点 (1) 基本原理 链酶亲和素是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，分子量60kD，不含糖链，等电点 PI 6.0。与亲和素相同也有四个生物素结合点，亲和力极高。与亲和素相比是一种更近于完美的生物素结合蛋白。链酶亲和素同一定浓度的生物素化酶混合后，就能形成链酶亲和素-生物素-酶复合物。这种复合物中至少存在一个尚未被生物素占据的亲和素结合位点，可以和各种生物素标记的抗体结合。这种复合物即是SABC (strept avidin-biotin complex)。 (2) SABC的特点 高敏感性； 低背景； 简便快速； 结果稳定, EnVison系统染色原理 与ABC法、SP法及SABC法的染色原理均不同，是将二抗与多聚螯合物酶（HRP或AP）通过化学方法连接在一起，形成多聚螯合物，在多聚螯合物上含有大量的酶分子和二抗，因此，比ABC法、SP法和SABC法具有更显著的放大作用，可高出几十倍。由于多聚物在人或动物体内不存在，因此，无非特异性染色，背景着色极轻。 染色步骤简便，在一抗反应后，切片经PBS洗涤后即可加入EnVison系统试剂，再经PBS洗涤后，可进行显色。,Ag,Ag,Primary antibody,Secondary antibody,Enzyme, AP or HRP,Illustration of EnVision method,16PBS洗涤切片，5 min3。 17DAB显色或AEC显色，或碱性磷酸酶标记的NBT显色。 （1）DAB显色液配置 DAB 20-50 mg 0.01mol/LPBS (pH 7.2-7.4) 100ml 或0.05mol/L Tris-HCl(pH 7.6) 30% H2O2 20-40l 配置方法：先以少量PBS或Tris-HCl缓冲液溶解DAB，然后再加入余量缓冲液，在显色前加入30% H2O2。将洗涤后的切片浸入显色液中5-10-20min，应闭光下反应，并随时在显微镜下观察结果，随时终止反应，也可使用商品化的即用型DAB。阳性反应部分为棕色，经核复染后，脱水、透明、树胶封片，但由于有致癌作用，配置时应注意防护。,（2）AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) 显色液 AEC 20mg 二甲基甲酰胺 (DMF) 2.5ml 0.05 mol/L 醋酸缓冲液 (pH 5.5) 50ml 30% H2O2 5l 配置方法：先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充分混匀过滤。临显色前加入H2O2, 切片显色时间5-20 min，也可使用商品化的AEC显色。该显色液作用后，阳性部分为红色，如以苏木素或亮绿复染核后，效果更佳，但终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。,（3）碱性磷酸酶（AKP）标记的NBT显色液 预先配置以下试剂： A 液：5% NBT（Nitro-blue-tetrazolium） 称取0.5gNBT溶于10ml 70% 的DMF，充分混合，保存于4，也可分装成小份，-20保存，用前复至室温。 B 液：5% BCIP（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate） 称取BCIP 0.5g，溶于10ml DMF内，混匀，4成分装，保存于-20，用前复至室温。 显色液：取A 液 40l，加入到装有10ml 的0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 9.5，含0.1mol/L NaCl，5mmol/L MgCl2）管内充分混匀，再加入B液40mol，轻轻混匀即可，最好临用前就配置，但在显色液中需加入Levamisole（左旋咪唑）在显微镜下随时观察显色反应，阳性结果为蓝色或紫色沉淀。 上述所提及的各种显色液目前均有以试剂盒形式出售，只要按说明操作即可，但价格较贵。,18. 自来水洗涤切片、核复染、脱水、透明、 树胶封片 经显色后，将切片放入自来水中，流水轻冲洗10分钟，再经蒸馏水洗后，放入苏木素中做核复染（显色切片）20s-1min，经酒精-HCl分化后，在放入自来水中继续分化细胞核至满意为止。 经70%、80%、90%、95%、100%、100% 酒精脱水各5min，二甲苯透明后，用树胶封片。,第三节 免疫组化染色的对照设置 在进行免疫组化染色时，必须证实组织内显示的反应产物，确实是抗原与相应的特异性抗体反应所产生的。由于免疫组织化学染色中影响抗原、抗体和免疫反应的因素很多，因此对免疫组织化学染色结果的评价必须设置对照组才能做出正确的判断。 常用的对照组有以下几种：,一、 阳性对照 用已证实含用待测抗原的组织，与待检标本做同样处理后，进行免疫组化染色，结果应为阳性，称为阳性对照。每次实验都应做阳性对照，通过阳性对照可证明靶抗原有一定活性，染色过程中各个步骤以及所用的试剂都合乎标准，染色方法可靠。特别是当待检的标本为阴性结果时，阳性对照呈阳性反应，可排除待检标本假阳性的可能。所以若预期染色结果是阴性时，就必须设阳性对照。,二、阴性对照 用确知不存在待检抗原的组织切片染色，结果为阴性。阴性对照可证实组织内若不含靶抗原，就不应染色，可排除在染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的“假阳性”结果。 三、空白对照 是最常用的对照，用不加一抗的缓冲液，如PBS替代一抗，染色结果应为阴性，说明染色方法可靠，可排除组织的内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶、自发荧光等物质引起的非特异性显色。,四、替代对照 用与第一抗体来源的同一动物免疫前血清，如第一抗体用的是兔抗人GFAP的 IgG抗体，对照中用非免疫性的正常兔IgG血清来替代一抗，以相同的稀释倍数进行对照染色。这可证明待检切片中阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是所用特异性抗体与组织细胞内待检抗原的特异性反应的结果。但使用的商品抗体往往不能用同一种动物的免疫前血清做替代对照，也可用未经免疫的同种动物血清，即非免疫血清替代一抗。,五、吸收试验对照 用过量已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部被抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应，故再做免疫组化染色时，结果应为阴性。 六、自身对照 用同一组织切片上与待检抗原无关的其它结构做对照。阴性反应与阴性结构同在一个视野中，相互印证，这本身就是对阳性反应的特异性对照。但进行科研工作中，单纯用这种对照是不科学的。必须增加如空白对照、替代对照等，才能使染色结果得到承认。现代国际上发表文章，在免疫组化染色的同时，还须有Western blotting做相应蛋白质检测的实验结果加以证实。,冰冻切片的免疫组织化学染色 冰冻切片的免疫组织化学染色也是常用的技术，但一般情况下不用，因为冰冻切片操作较复杂，不易操作，要求标本必须是深低温快速冷冻，标本不如石蜡块易保存等，但优点是组织的各种抗原保存好。因此一般情况下，只有在应用石蜡切片进行免疫组化染色，包括经过抗原热修复或蛋白酶消化后，仍不能得到阳性染色结果时，才考虑使用冰冻切片染色。,第四节 双重免疫组织化学染色 应用免疫组织化学染色方法在同一张组织切片或细胞涂片上同时或先后显示两种抗原成分，即为双重免疫标记。光镜下通过标记物或其反应生成物的颜色来标记不同的抗原成分，以帮助研究者了解含有这些不同抗原的各类细胞、组织之间的相互关系。 可能遇到的问题是：后一种免疫染色所用的抗体系统可能与前一种染色所用的抗体系统发生交叉反应，从而造成叠加污染，失去双重染色的准确性和意义。为避免这种交叉反应，研究者建立了一些方法，按其作用原理和方式，可分为洗脱法和非洗脱法。,一、洗脱法 1. 基本原理： 可选用同种动物产生的特异性抗体（如兔抗X和兔抗Y IgG 抗体）为一抗，另一种动物相应的抗体（如生物素标记的羊抗兔IgG抗体）为二抗，用ABC、SP或SABC方法，或应用EnVison方法进行染色，用不同的酶和底物系统呈色。在完成第一种免疫组化染色后，将抗原抗体复合物洗脱，再做第二种染色。 2. 洗脱液： （1）甘氨酸-盐酸溶液(pH 2.2)：0.1 mol/L盐酸+0.757%（0.1mol/L）甘氨酸溶液95ml（0.1mol/L的氯化钠溶液配制）。用该溶液洗切片2h，一般能够消除第一种染色的抗体系统与下一种染色的交叉反应，但保留显色反应所得的颜色。,（2）高锰酸钾-硫酸洗脱液：1 ml 2.5% KMnO4，1ml 5% H2S04，加140ml蒸馏水混匀。 3. 洗脱法的一般步骤 按常规做第一种免疫组化染色，可选用HRP为标记物，显色底物为4-氯萘酚，阳性部位反应产物为蓝色。 开始第二种染色前，先将切片经蒸馏水洗，再用酸性溶液洗脱。如用pH 2.2的甘氨酸-盐酸溶液须浸洗2h左右，如用高锰酸钾-硫酸洗脱液则要5min左右，再将切片移入0.5%的焦亚硫酸钠（Na2S2O5）水溶液中还原30s，经水洗10-20min，蒸馏水洗5min， 按常规进行下一种免疫组化染色。第二种染色选用DAB为显色底物，生成物呈棕褐色，与第一种染色中生成的蓝色可形成比较鲜明的对比。,二、非洗脱法 （一）直接法 如果采用不同种酶标记在不同的第一抗体上，则只能用顺序染色法。即先做第一种染色，用第一种底物与已定位的酶反应呈色，再进行第二种染色。 （二）标记双抗原法 两种一抗分别来自不同种动物，二抗分别来自另外两种不同动物，且标记两种酶分别作为标记物做双重染色时，一般第一种染色选用HRP，而在第二种染色中可按需要选择不同的酶。如选用ALP，还可用不同的底物呈现不同的颜色，如坚固蓝呈现的蓝色可与DAB的棕色形成良好的对比，坚固红虽然与DAB的棕色对比相对较差，但也可选用。,（三）活性灭活法 是一种新建立的方法，主要是根据通过在溶液中加热灭活第一次染色中的抗原、抗体和酶活性后再进行第二种染色的原理而设计的。用于灭活的溶液介质一般是柠檬酸缓冲液（pH 6.0），灭活的温度一般是96左右。本法的优点是用于染色的一抗、二抗可分别来自于同一种动物，方便了抗体的选择，只是选用不同的显色酶和底物。但缺点是所要显示的第二种抗原必须耐热。,免疫荧光染色及多重染色技术 Single and multiple immunofluorescent labeling,原理：是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗体或抗原标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。 方法：直接法、间接法。,检测方法,一、直接法 用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下可见抗原存在部位呈现的特异性荧光。此法特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。,二、间接法 是直接法的重要改进，先用特异性第一抗体抗体与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用标记荧光的第二抗体与结合在抗原上的抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性，与直接法相比荧光亮度可增强34倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，适用于多种抗原的标记显示，是目前最广泛应用的技术。,间接法染色原理,标记不同荧光发色剂的商品化二抗： 1. Alexa Fluor 555，显示红色荧光； 吸收光谱峰值：555nm ，激发光谱峰值：565nm 。 2. Alexa Fluor 488，显示绿色荧光； 吸收光谱峰值：495nm ，激发光谱峰值： 519 nm 。 3. Alexa Fluor 350，显示蓝色荧光。 吸收光谱峰值：346nm ，激发光谱峰值： 442nm 。 4. Hoechst 33258，标记细胞核，或细胞凋亡检测，蓝色。 吸收光谱峰值： 346nm，激发光谱峰值： 460nm,双重或三重免疫荧光标记法 Double and triple immunofluorescent labeling,目的： 1. 双重染色：同时显示细胞中的两种抗原或一种抗原+标记细胞种类； 2. 三重染色：同时显示细胞中的三种抗原或两种抗原+标记细胞种类。 方法：直接法、间接法,直接法：将两种或三种来自不同种属，并标记了可发出不同颜色荧光的抗体（如抗A、抗B、抗C）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用发黄绿色荧光素标记，抗B抗体用发红色荧光素标记，抗C抗体用发蓝色荧光素标记明确显示两种或三种抗原的定位。,间接法：将两种或三种来自不同种属的抗体（如抗A、抗B、抗C的IgG抗体）同时或分别孵育切片后，再选用标记了可发出不同颜色荧光另外不同种属的抗IgG抗体孵育切片，进行双重或三重免疫荧光染色，是目前常用的检测技术。,免疫荧光染色注意事项,免疫荧光染色的基本程序近似于酶免疫组织化学染色，但应注意以下问题： 1. 免疫荧光不需要用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2. 二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 3. 免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油（0.01M PBS 1：1）。建议购买抗淬灭的封片液，使切片可以保存更久。 4. 荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 5. 免疫荧光染色假阳性可能多，需分别设定阳性和阴性对照。 6. 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。,第五节 细胞凋亡的检测技术 一、凋亡细胞的形态学改变 细胞表面：伪足、微绒毛等消失 细胞体形态：细胞皱缩、变形，体积变小 细胞核：染色质浓缩、早期染色质聚集于核膜边，呈新月形 或环形，晚期碎裂 细胞器：密集但形态及结构完整，早期内质网短暂扩张 细胞膜：完好，晚期包裹细胞器或核碎片，形成凋亡小体 在组织中表现：常常以单个细胞散在发生 周围组织反应：凋亡细胞或小体被邻近巨噬细胞、上皮细胞 吞噬、降解，不发生炎症反应 发生条件：属于基因控制的程序性细胞死亡，多发生于器官 萎缩、细胞介导的免疫杀伤机制、小剂量毒素作 用以及多种病理生理状态,二、细胞凋亡的形态学检测方法 （一）凋亡细胞的光镜和荧光显微镜检测 1制片 （1）常规组织学切片，进行脱蜡和水化。 （2）培养细胞可用细胞离心仪制片。由于凋亡细胞在制片中容易破碎，所以应采用低速离心制片（250g，离心5min），并事先将载玻片用1%BSA处理，使细胞易于贴附。离心后涂片，稍经空