ELISPOT技术原理及其应用

酶联免疫斑点 Enzyme Linked ImmunoSPOT,达科为生物技术有限公司 朱义鑫 2005.11.30,Elispot实验结果（透明板）U-Cytech 公司 Elispot实验结果（PVDF板）U-Cytech 公司,ELISPOT技术起源与发展 细胞与细胞因子 ELISPOT技术原理 ELISPOT 和 ELISA的区别 ELISPOT的优点,第一部分：前言,1983年, Czerkinsky 同年业发展出双色标记技术； 1995年，Schielen et.al.: 首次将PVDF膜板引入ELISPOT 1997年，Gui et.al.：发展出计算机辅助的斑点技术技术。,1.ELISPOT技术起源与发展,T细胞在免疫系统中起着关键性的作用，尤其是起免疫调节作用的辅助细胞Th。它们参与了细胞免疫(Th1)和体液免疫(Th2) 抗原或者有丝分裂原刺激T细胞、单核/巨噬细胞分泌细胞因子 Th1 cells IFN-,IL-2 Th2 cells IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 Tc cells IFN-, TNF-, 颗粒酶B，穿孔素 单核/巨噬细胞 TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-10, IL-12 细胞因子的分泌以及对效应细胞的调节构成了一个精确的免疫系统调节网络。,2.细胞与细胞因子,用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以斑点显色的方式将其表现出来。,3.ELISPOT技术原理,4.ELISPOT 和 ELISA的区别,ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展。两者都可检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同:,ELISA测定的是蛋白浓度，ELISPOT测定的是细胞频率；（整体水平与单细胞水平） ELISA是免疫检测Immuno-Assay，而ELISPOT是生物检测Bio-Assay（活细胞，功能检测） ELISA检测的特异性表现在抗体上，ELISPOT检测的特异性及表现在双重的刺激源和抗体上。,5.ELISPOT的优点,目前，检测细胞因子或者细胞免疫反应的方法有以下几种：ELISA、ELISPOT、FACS、Tetramer、3H胸苷参入法、51Cr释放法。 高灵敏：度少至1001,000个分子/Cell即能够被检测。比ELISA的灵敏度高200倍。 单细胞水平：即使只有一个阳性细胞也能够检测出来，比FACS灵敏。 高通量：每个研究人员每天可作数百样本的检测。High Throughput Screening,在106抗原呈递细胞（APC）中混入已知数量的IFN-阳性T淋巴细胞，然后用三种方法分别进行检测。,X坐标：各检测方法的检测结果 Y坐标：每百万APC中实际IFN-+T细胞数量,ELISPOT/FACS/ELISA 检测精确度比较,ELISPOT 流式荧光染色 ELISA,第二部分：技术特点,技术操作流程 ELISPOT技术要点 塑料板与膜板 膜结构与抗体包被 细胞处理 有血清与无血清 刺激物选择 建立阳性对照 调整适当的细胞浓度 预培养法与直接法 各种染色系统,包被抗体 4 过夜，洗涤； 封闭37 1h； 加入淋巴细胞和刺激原37 孵育8-40h； 冰水裂解并移出细胞，洗涤； 加入生物素标记的检测抗体37 1h，洗涤； 加入酶联亲和素37 1h，洗涤； 加入显色底物，显色1040min； 获得斑点，计数。,1，2,3,4,5,6,7,8,1. ELISPOT一般操作流程,2. ELISPOT技术要点,细胞培养和培养前阶段无菌操作，避免污染 细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动，包括开关CO2孵箱 洗涤要充分，尤其是裂解细胞之后的洗涤 洗涤时，枪头不能接触到膜，从孔中移出液体采用倾倒的方式 洗涤最后一次要用高质量的吸水纸拍干,塑料板：U-cytech公司特有的透明版 操作简单，方便，省时，价廉，但是斑点不如膜板漂亮，适于初学者以及临床诊断。 膜板：PVDF膜板、NC膜板 操作复杂，但是斑点漂亮，适合有经验的实验者以及科学研究。,3.塑料板与膜板,塑料板：U-cytech公司特有的透明版,优点： 透明全塑料板，易于操作，可以随时观察细胞； 可以快速包被，节省实验时间； 可回收细胞和上清； 价格只有PVDF膜板的一半。 缺点： 吸附能力比膜差，斑点松散，易受粒细胞的分解； 裸视下斑点为灰白色，不如有颜色斑点明显； 只有一种染色系统，不能用于多色分析。,修饰的HRP/银染系统,膜板：PVDF膜， NC膜,优点： PVDF膜的吸附能力更强，斑点致密、圆润； 斑点颜色鲜艳，易于判读； 能用于多色ELISPOT实验。 缺点： 需酒精预湿等步骤，操作稍复杂； 因为膜的渗漏问题，在洗涤步骤稍复杂； 几乎不可能回收细胞和上清； 膜的脆弱性，实验中的操作与保存更困难。,HRP/DAB,AP/BCIP&NBT,HRP/AEC,IFN-,IL-5,IL-10,IFN-,PMA/ionomycin 2.5x104 hu-PBMC indirect,tetanus 105 hu-PBMC indirect,ConA 2.5x104 hu-PBMC indirect,ICE Peptide Pool 2x105 hu-PBMC indirect,IL-5,IL-12p70,IFN-,PMA/ ionomycin 2x105 hu-PBMC indirect,LPS/ IFN- 2.5x104 hu-PBMC direct,ICE Peptide Pool 2x105 hu-PBMC indirect,PVDF板、透明板的典型斑点图像,4. 膜结构和抗体包被,通常的包被条件是4过夜，也可以室温2小时 37 包被不能超过1小时，否则包被效率急剧降低 膜吸附能力远远超过包被抗体的量，所以需要封闭 包被后必须接着封闭，否则包被抗体会逐渐失活 封闭之后用纯水或PBS洗涤，可以在4长期存储,关于膜的一些参数（单孔面积） 厚度：120-150um 最大蛋白吸附量： 80-100 ug ELISPOT所需量：1 ug 包被抗体集中于膜表面1um (透明板容纳量为：30-40 ug),从外周血提取淋巴细胞时, 应避免凝血引起的细胞活性降低；血液越新鲜越好，全血不应该存放超过6小时。 只能采用淋巴细胞提取液分离。提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞、粒细胞和杂质的干扰 从小鼠的脾脏取淋巴细胞时，尤其要注意，加入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液 预培养的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液变黄）会影响斑点的形成 预培养后的细胞入ELISPOT培养板前应更换培养液,ELISPOT实验的难点在于细胞处理与培养,5. 细胞处理,6. 有血清与无血清,血清是细胞培养所必需的添加品 ，ELISPOT有细胞培养的过程，所以需要血清 但是血清批次间差异大、成分未可知，为ELISPOT增加了严重的不确定性因素。有些批次的血清严重干扰试验结果。 无血清培养法已经成熟，其优点： 成分固定，彻底消除了批次间的差异，结果可以在全世界的试验室之间比较。 不含杂蛋白，背景更弱，斑点更清晰。 不含抑制细胞因子分泌成分，斑点更多，更加反映真实的结果。 目前只能用于直接法，间接法孵育时间过长，细胞生长受影响，结果不理想。,119 SFC,267 SFC,我们自己的试验结果：PHA/10,000 Hu-PBMC 上：5%小牛血清（杭州）下：无血清培养基U-cytech),非特异性刺激物 有丝分裂原 ConA，PMA，PHA，Ionomycin 特异性刺激物 重组蛋白 病毒载体或者病毒颗粒 重叠肽段 表位肽 注意： 直接在ELISPOT培养可能会因没有足够的刺激强度而导致斑点数少。此时可以采用预培养法。 部分多价抗原刺激物导致细胞凋亡，可以换用单价抗原刺激物。 核酸、激素等抗原刺激物的免疫原性较弱，应该加强刺激浓度、辅助刺激物、延长刺激时间等。,7. 刺激物选择,8.建立阳性对照,非特异性刺激阳性对照： ConA 伴刀豆蛋白A 0.4-1.0ug/well PHA 植物血球凝集素 0.3-1.0ug/well Ionomycin 伊诺霉素 50-100ng/well PMA 14烷酰佛波乙酯 5.0-10ng/well 特异性阳性刺激原：国际标准多肽池CEF CMV， EBV， influenza virus,在PBMC的IFN- ELISPOT 分析中： 自发斑点频率：1050/百万PBMC细胞；(十万分之一） PHA刺激频率：104105/百万PBMC细胞；（百分之一） CEF刺激频率：500 5000 /百万PBMC细胞（千分之一）,阳性对照实例,未 刺 激 40SFC/百万PBMC,CEF 刺 激 3，400SFC/百万PBMC,PHA 刺 激 26，000SFC/百万PBMC,人PBMC40万/孔 U-cytech无血清培养基,人PBMC1万/孔 U-cytech无血清培养基,人PBMC5万/孔 U-cytech无血清培养基,4,265,177,9.调整适当的细胞浓度,844 492 355 192,40万 20万 10万 5万,20-40万/孔形成最大密度的单层细胞 根据所使用刺激原作初步调整 ConA PHA PMA ：0.5-5万/孔 特异性刺激物：5-40万/孔 根据预实验的斑点数目作精细调整,人PBMC/CEF刺激 U-cytech无血清培养基,10. 预培养法与直接法,预培养法即：预先将细胞和刺激物加入24孔板中作预孵育和刺激，然后再加入ELISPOT板进行实验。 大多数ELISPOT实验都可以用直接ELISPOT法得到可接受的结果。 预孵育的优点： 经过预孵育，斑点更分散，清晰 可以除去贴壁的巨噬细胞，从而减少小斑点的影响；粒细胞的影响（虫啃）也可以大大减轻 某些细胞因子通常很难用直接法得到结果，比如颗粒酶、IL-10 预孵育的缺点： 需要长时间孵育刺激，更为严格的无菌操作环境 需耗费额外的物资和时间,直接法PVDF 刺激物：ICE Peptide Pool 40 Hours,2 X 105 Cell/ Well,预孵育法PVDF 刺激物：ICE Peptide Pool 24+16 Hours,2 X 105 Cell/ Well,IFN-直接法与预培养法比较,直接法PVDF 刺激物：破伤风杆菌 40Hours, 2X105Cell/Well,预孵育法PVDF 刺激物：破伤风杆菌 24+16 Hours, 2X105Cell/Well,IL-10直接法与预培养法比较,11.各种染色系统,修饰的HRP/银染系统,HRP/AEC,AP/BCIP&NBT,HRP/DAB,透明板：只有一种修饰的HRP/银染系统，白色不透明斑点。 PVDF板：两种标记酶 辣根过氧化物酶HRP-显色快，但是背景高(30min) AEC底物，颜色鲜艳，但易退色 DAB底物，棕色斑点，着色稍牢固，但是板点松散 碱性磷酸酶AP-显色慢，但是背景干净(2h) BCIP&NBT混合底物，蓝黑色，着色牢固,第三部分：常见问题,0. 无斑点 斑点过少（影响斑点数量的因素） 斑点过密 斑点聚集在孔边缘问题 斑点变花或者“拖尾” 透明板“空斑”问题 斑点明显偏大，并且弥散 PVDF膜酒精预湿处理中的问题 细胞凋亡对ELISPOT的影响,ELISPOT影响斑点形成的因素,Quality antibody pair Solid support (polystyrene, nitrocellulose, PVDF) Cells from STLV/HTLV-infected animals/humans Cell source of tissues Cell composition (T cells, monocytes/macrophages, granulocytes, erythrocytes etc.) Kinetics cytokine production Coloring system Washing conditions/dilution buffer Preincubation (yes or no),斑点过密，细胞数量过多,844 192,40万/孔 5万/孔,Human PBMC, stimulate by CEF peptide pool,人PBMC/CEF刺激 U-cytech无血清培养基,斑点聚集在孔边缘问题,细胞集中于孔边缘 与细胞在孔边缘的“层流阻滞”作用相关 常见于PVDF膜板，膜的自然曲率影响 改善方法 接种细胞之后，不要摇动、振荡 细胞体积不要超过100uL 培养箱质量，铝箔包裹均匀受热 方型孔板可杜绝细胞（斑点）的边缘效应 洗板时的流水冲击力过大 见于使用自动洗板机的情景,这是震动所导致的斑点拖尾,4. 斑点变花或者“拖尾”,这是细胞趋化所导致的斑点变花,细胞在培养过程中震动导致斑点拖尾 大部分斑点清晰，但部分出现“拖尾”，这并非震动的原因 主要原因是DC所导致的细胞趋化作用 常见于多价刺激，没有固定的DC比例，有很大的个体差异,5. 透明板“空斑”问题,主要原因是粒细胞分泌或分解所至的酶解现象 PVDF膜板因底部是白色的膜，同时斑点更致密而几乎看不出来 改善方法 采用单价刺激物，多价刺激物时更容易出现 与PBMC分离的质量密切相关 采用预孵育法可大大减轻这一现象,我们自己的一个例子 （透明板，PBMC，乙肝核心抗原蛋白）,6.斑点明显偏大，并且弥散,这与包被抗体的质量、浓度有着密切的关系 随着包被抗体浓度的增加，斑点变得清晰致密 由于透明板的吸附能力差，这个问题更突出一些,0.2ug/well,0.5ug/well,1.0ug/well,斑点偏大，弥散：我们自己的例子 （透明板，PBMC，乙肝核心抗原蛋白）,7. PVDF膜酒精预湿处理问题,不作酒精预湿,过量酒精残留,PVDF膜由于其疏水性，需要酒精预湿润 有些公司的产品声称不需要预湿，但是斑点减少30-40% 由于膜的通透性，加入过量酒精会导致其残留在膜的背面 正确方法 减少酒精用量至 15ul 70% 乙醇 快速预湿 30秒，迅速用水或PBS洗涤至少三遍,一个客户的实例,细胞凋亡是高背景、无斑点的重要原因 如果有30细胞凋亡，完全不会出斑点；即使5凋亡，也有严重影响 对策： 台盼蓝活细胞计数 复苏冻存的细胞，可以先培养过夜，再做ELISPOT实验,8. 细胞凋亡对ELISPOT的影响,第四部分：ELISPOT应用,ELISPOT在国外的应用已经非常普遍，成为一项免疫学检测常规技术。凡是免疫学相关领域，都可以应用ELISPOT技术。 我们国内，主要用疫苗研究方面，尤其是艾滋病疫苗。 中国药品生物制品检定所： 2003年 预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指标原则“使用ELISPOT方法检测淋巴细胞分泌干扰素功能，应该作为检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方法” WHO：WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003年 在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，推荐使用ELISPOT检测淋巴细胞分泌干扰素功能。在我国举办了技术培训学习班。 ELISPOT在国内大规模应用的时代已经到来。,国外ELISPOT应用,疫苗研究 HIV疫苗：在小鼠上检验抗原性；在猴体检验保护功效；在人体检验免疫原性；研究猴子感染SIV动力学；I型与II型HIV引发的CTL反应差别； HBV疫苗：疫苗的免疫原性；疫苗的治疗效果；疫苗的给药途径；不同病人的敏感性 肿瘤疫苗 抗肿瘤甲胎蛋白和热休克蛋白DNA疫苗；DC疫苗预防胃癌；DC疫苗治疗白血病；卵巢癌中的细胞免疫情况；日本临床DC疫苗治疗黑色素瘤的情况 其它疫苗：疟疾疫苗：疟疾疫苗产生的CD4+8+和体液免疫反应；克隆病疫苗；肝癌疫苗；HPV疫苗； 抗原表位筛选： 结核杆菌的CTL表位；丙肝CTL表位；HIV-1表位肽；用肽库筛选T细胞表位肽；HIV蛋白酶和整合酶功能域中的CTL表位；痘病毒的T细胞表位 自身免疫病研究、诊断 风湿性关节炎、红斑狼疮 研究红斑狼疮患者肾中的抗体分泌细胞的影响 牛皮癣（银屑病）：致病机理，易感病人预测，治疗效果评估 I-型糖尿病：致病机理，临床检测，易感病人预测 麻风病 多重硬化症 结核病：多重抗药性、症状不明显的结核病早期诊断 器官移植 肾移植 肝移植 骨髓移植：次要组织相容性抗原(H)在骨髓移植中的影响；肝移植免疫耐受 研究CCR2在移植排斥中的角色；研究移植耐受性差异； 免疫系统研究 研究抗体分泌细胞：B细胞的成熟；活化；抗体分泌细胞在粘膜的分布 研究粘膜免疫反应：不同的粘膜部位；局部免疫与系统免疫；各种疫苗的粘膜保护效果 研究基础免疫学：研究基因治疗中的外源蛋白免疫耐受；肿瘤疫苗对细胞免疫的刺激；研究DC细胞的功能调节；抗疟疾研究；HIV患者中细胞免疫强度和病毒载量的关系；同时评估多种细胞免疫反应；测定针对原生肿瘤细胞的免疫反应；急性丙肝病人体内的细胞免疫反应；老年人对流感病毒免疫反应低下的原因分析；,ELISPOT在国内的应用,HIV疫苗 HBV(乙肝)疫苗 SARS疫苗 HEV(戊肝)疫苗 乙肝诊断与治疗评估 I-性糖尿病诊断 肝移植排斥反应 B细胞抗体分泌研究,ELISPOT在HIV疫苗研究中的应用,体液免疫与细胞免疫：细胞免疫在控制HIV主治方面发挥了主要作用 目前没有任何疫苗能预防HIV的感染，但是可以减轻感染之后的发病情况，甚至不再发病。 评价HIV疫苗的好坏不再与看它激发的抗体，而在于看它激发的病毒特异性细胞免疫反应。 目前评价这个指标最好的方法就是：ELISPOT!,疫苗免疫两周后，猴PBMC对HIV病毒裂解物的IFN-ELISPOT反应 A, 肌肉与粘膜联合免疫；B,单独肌肉免疫。 Makitalo B. et. al. Enhanced cellular immunity and systemic control of SHIV infection by combined parenteral and mucosal administration of a DNA prime MVA boost vaccine regimen. J Gen