酶学分析技术

第七章 酶学分析技术,本章内容概要：,第一节 酶活性测定的基本知识 第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型 第三节 同工酶测定 第四节 酶学分析在临床诊断上的应用 第五节 酶活性测定最适条件的选择,1、掌握酶活性的国际单位定义，酶活性浓度的表示方法及酶活性单位的计算公式；酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果的计算方法；酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用；以NAD（P）H为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用.,本章教学要求：,2、熟悉酶促反应进程；酶促反应底物动力学；酶学分析在临床诊断上的应用。,3、了解Km值、Vmax值的应用及Km和Vmax的测定；同工酶测定和酶活性测定最适条件的选择。,第一节 酶活性测定的基本知识,酶活性的概念 酶活性单位 酶活性单位的计算 酶促反应进程 酶促反应底物动力学,一、酶活性的概念,酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。,底物浓度为S,产物浓度为P,时间为t，反应速度为v,v =-dS/dt 或 v =dP/dt。,注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。,二、酶活性单位,定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。,惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。 国际单位 ：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，每分钟转化1mol底物的酶量。单位为IU/L 。 Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的 酶量，1Katal=60106IU。,三、酶活性单位的计算,步骤：,明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位，,计算公式:,产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml） 酶单位/升 = 每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml）,分光光度法测定的公式：,（A测定 A对照）V总106 每单位规定的保温时间 酶单位/升 = LV标 实际保温时间,四、酶促反应进程,酶促反应进程曲线,酶量的测定：,通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量，应使酶浓度（E）与酶促反应速度成正比，即E-dS/dt或EdP/dt。能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。 酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。,酶的含量,酶活性,酶促反应初速度,五、酶促反应底物动力学,中间产物学说：,酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催 化底物反应生成产物。E + S ES E + P,米-曼氏方程：,VmaxS v = S+ Km,上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度，S代表底物浓度，Km称为米氏常数。,（一）米氏常数的定义,由米-曼氏方程可以导出：,（Vmax-v）S Km = v,当v = 1/2Vmax时，Km =S。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。,（二）Km值的应用,1.鉴定酶的种类,Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与 酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种 类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的 条件下测定其Km值加以鉴定。,表7-1 某些酶的Km值,酶 底物 Km(mmol/L),乳酸脱氢酶 丙酮酸 0.017 己糖激酶 D-葡萄糖 0.05 D-果糖 1.5 -半乳糖苷酶 D-乳糖 4.0 碳酸酐酶 H2CO3 9.0 过氧化氢酶 H2O2 25 蔗糖酶 蔗糖 28 糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸 108,2.反映酶与底物的亲合力,Km值越大，酶与底物亲合力越小， Km值越小，酶与底物亲合力越大。,3.选择酶的最适底物,Km值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底物有不同的Km值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，使酶促反应容易进行，并节省底物用量。,4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的比率,根据米-曼氏方程可以计算,5.设计适宜的底物浓度,酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶 活性，一般要求初速度达到最大速度的90%95%、底物 消耗率为1%5%。这样既可以近似地表示酶活性，又不 致于使底物浓度过高而造成浪费。,(三)Vmax的应用,定义 ： Vmax指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。,应用： Vmax可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子 酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。当反 应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的 转化率：,TN =底物转化量（mol/s）/酶量（mol）,(四)Km和Vmax的测定,1Linweaver-Burk作图法,又称为双倒数作图法,1 Km +S Km 1 1 = = + v VmaxS Vmax S Vmax,2Cornish-Bowden作图法,又称为直线线性作图法。,第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型,酶活性的测定方法 工具酶 酶偶联测定法 底物浓度测定,一、酶活性的测定方法,按照对酶促反应时间的选择不同,连续监测法,固定时间法,（一）固定时间法,分类：,终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。 两点法：该方法反应时间的预定是从t1t2 。,定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。,特点： 优点是简单。 缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。,注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以3060分钟为宜。,（二）连续监测法,原理：,定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。,该方法每隔一定时间（10s60s）测定一次底物或产 物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图 ，绘制反应速度曲线。,特点： 在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法,缺点： 要求高，要求能够精确地控制温度、pH值和底物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求。,优点: 能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。,二、工具酶,定义：,偶联：工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。,工具酶：将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。,工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类,分类：,表7-2 常用工具酶的名称及其缩写符号,名 称 缩写符号 名 称 缩写符号,乳酸脱氢酶 LDH 苹果酸脱氢酶 MDH 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 G6PD 谷氨酸脱氢酶 GLDH 葡萄糖氧化酶 GOD 胆固醇氧化酶 COD 磷酸甘油氧化酶 GPO 过氧化物酶 POD,己糖激酶 HK 肌酸激酶 CK 丙酮酸激酶 PK 甘油激酶 GK 脂蛋白脂肪酶 LPL 胆固醇酯酶 CE 脲酶 肌酐酶,三、酶偶联测定法,应用：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应 。,Ex Ea Ei A B C P,式中A为底物，B、C为中间产物，P为产物（必须能够直接测 定），Ex为待测酶，Ea、Ei都为工具酶。按照工具酶作用的不同， Ea又称为辅助酶，Ei又称为指示酶，C P称为指示反应。,（一）酶偶联反应的原理,在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定。,（二）常用指示酶及其指示反应,1脱氢酶,用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶，例如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它们催化下列反应：,P + NAD(P)H + H+ PH2 + NAD(P)+,可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定,应用：ALT、AST、CK等酶活性测定。,2过氧化物酶,POD可催化过氧化氢与某些色原反应，例如与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：,POD 2H2O2 + 4-AAP + 酚 醌亚胺（红色） + 4H2O,Trinder反应：,应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通过Trinder反应加以测定。,四、底物浓度测定,利用酶催化反应的高效率和专一性，可以测 定底物浓度。与酶活性测定类似。,第三节 同工酶测定,同工酶的定义 同工酶产生的机理 同工酶的测定方法,同工酶的定义,是催化功能相同，但是分子组成及理化性质不同 的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等位 基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。,一、同工酶产生的机理,（一）由不同基因位点编码 （二）由等位基因编码 （三）由多肽链化学修饰产生,二、同工酶的测定方法,（一）按照理化性质不同进行分离鉴定,1电泳法 同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率 也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。,2层析法,根据同工酶分子荷电量不同，可用离子交换层析法 加以分离。,（二）按照底物专一性不同进行鉴定,同工酶底物专一性不同，Km值也不同。如果同工酶之间的Km值差别足够大，可以通过测定其Km值加以鉴定。,（三）按照最适pH不同进行鉴定,同工酶分子氨基酸组成不同，最适pH也不同。如果同工酶最适pH之间的差别足够大，可以通过调节缓冲溶液的pH值加以鉴定。,（四）按照免疫学特性不同进行分离鉴定,（五）按照耐热程度不同进行鉴定,（六）选择性抑制法,第四节 酶学分析在临床诊断上的应用,血浆酶的来源 酶的区域化分布 酶活性测定在临床诊断中的应用 同工酶的诊断价值,一、血浆酶的来源,血浆酶,血浆特异酶,非血浆特异酶,外分泌酶,细胞内酶,二、酶的区域化分布,表7-3 诊断常用血清酶的来源,血清酶 符号 来源,鸟氨酸氨基甲酰转移酶 OCT 肝 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 肝 谷氨酸脱氢酶 GLDH 肝 山梨醇脱氢酶 SDH 肝 丙氨酸氨基转移酶 ALT 肝、肾、心 异柠檬酸脱氢酶 ICD 肝、胎盘、心 -谷氨酰转肽酶 -GT 肝、胆、肾、小肠 5-核苷酸酶 5-NT 肝、胆道 单胺氧化酶 MAO 肝、肾、脑 天门冬氨酸氨基转移酶 AST 心、肝、骨骼肌 肌酸激酶 CK 骨骼肌、心、脑 乳酸脱氢酶 LDH 心、肾、骨骼肌、肝、肺 碱性磷酸酶 ALP 小肠、胎盘、肝、肾 酸性磷酸酶 ACP 前列腺