chap06DNA重组的操作.ppt

,切,接,转,增,检,第六章 DNA重组的操作,6.1 DNA的体外重组,黏、平端连接 同聚物加尾 人工接头 gateway克隆,6.1.1 黏端连接,5,5,EcoR I,退火,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,特点,操作简便 正反向插入 载体自连 串联重组体,同尾酶,BamH I,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,GATCA,T,5,退火,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,T4-DNA ligase,5,5,Bcl I,6.1.2 平端连接,连接效率低 方向不确定 多拷贝插入,同聚物加尾 衔接物连接 接头连接,C 3,G,G,5,G 3,C,5,C,3 G,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dTTP,dATP,GTTTTTTTTTT 3,C,退火,C,3 TTTTTTTTTTG,G,G,3 AAAAAAAAAAC,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,S1,C,3,加热,CAAAAAAAAAA 3,5突出末端,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,5 AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,Klenow,补平,Klenow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,GAATT,CTTAA 5,5,5 AATTC,TTAAG,TdT,TdT,dGTP,dCTP,GAATTGGGGGG,CTTAA,AATTC,GGGGGGTTAAG,GGATCCCCCCC,CCTAG,GATCC,CCCCCCCTAGG,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,退火,BamH I,BamH I,EcoR I,BamH I,3突出末端,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3,C,退火,Pst I,Pst I,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,Pst I,Sph I,特点,无自身环化 连接效率高 操作繁琐 插入片段回收,平端ds 812 bp 酶切点,衔接物连接,5-GATCCCCGGG-3 3-GGGCCCTTAA-5,5GATCCCCGGG-3 GGGCCCTTAA-5,G CCTAG-5,5 3,GATCCCCGGG-3 GGGCCCTTAA-5,G CCTAG,5 3,fragment with EcoRI compatible ends,anneal,ligation,fragment with BamHI sticky ends,接头分子连接,6.1.3 Gateway载体系统,特征,位点重组 重组保守 核心序列 拓扑结构,溶源:Int & IHF,裂解:Int、 Xis、 IHF,Gateway克隆技术的特点,快速高效 不同载体间转换 避免假阳性 成本;载体扩增,物理法 化学法 生物学,6.2 重组DNA的转移,6.2.1 重组体导入E.c,Ca+2诱导E.coli转化,电穿孔法,高压放电 瞬间通道 膜恢复,6.2.2 重组体导入真核细胞,原生质体法 Li+介导法 PEG法 电击法,1. 导入酵母细胞,蜗牛酶(5mg/ml,3.5h),2. Gene transfer to plants,载体介导 直接导入 种质系统法,外植体伤口,共培养,A.t,AS,Ap、头孢,转化和非转化,kan、hyg,转化组织,转化苗,整合,YFG + Ti 重组质粒 转化Agro,virA受体virG活化蛋白vir启动子区virB、D、E接合孔复合体加工、转运整合,Electroporation,Microprojectile bombardment,简便、靶受体广、安全无污染 随机整合、嵌合体、转化率低,Biolistic PDS-1000 (He),Helium system,化学法,PEG、pLO、磷酸钙 原生质体 伤害小;无嵌合体 再生难;无性系变异大,Pollen tube pathway,卵细胞或合子 无需培养、再生 简便易行,周光宇 (1918-2007),6.2.4 Gene transfer to animal cells,磷酸钙沉淀 病毒感染 显微注射 脂质体法,Microinjector(ZEISS),胚胎细胞 转化率高 细胞固定 技术苛刻,Lipid vesicles,(A) An electron micrograph of unfixed, unstained phospholipid vesicles, liposomes, in water rapidly frozen to liquid nitrogen temperature. The bilayer structure of the liposomes is readily apparent. (B) A drawing of a small spherical liposome seen in cross section. (C) A liposome is a small aqueous compartment surrounded by a lipid bilayer,Transduction & Transfection,Transduction: This describes virus-mediated gene transfer. Certain animal viruses naturally infect human and mammalian cells. They include both DNA viruses (SV40, adenovirus) and RNA viruses (retroviruses). Modifications of these viruses can be used as vectors to transfer exogenous genes into suitable target cells at high efficiency. Transfection: This describes nonviral mediated gene transfer. It is analogous to the process of transformation in bacteria. Gene transfer can be carried out by various methods.,5. 转化率及其影响因素,转化细胞与细胞总数之比 转化率= 转化子数/受体细胞总数 每g DNA所产生的转化子数 转化率= 转化子数/每g DNA,1g pMD18有3.41011分子 108/3.41011 = 1/3400,已知转化率和RF可以帮助设计重组实验的规模,转化率的用途,某重组实验RF=20%, 转化率107/g载体, 切接处理的载体转化率比天然的低100, 欲获得104个重组克隆, 需投入多少载体分子？ 若Rf =1, 产生104个重组子: 104/(1070.01) = 0.1 g DNA RF =20%, 投入载体: 0.1/20% = 0.5 g 按10:1投入,5104个克隆,1000克隆/皿,需涂布?,转化率的影响因素,载体构象 受体细胞 转化手段,SC最高,切接100 大质粒, 转化率,原生质体 105106 Ca2+ 104105/g 转染 107108 电击 108109,6.3 重组子的筛选与鉴定,直接筛选 DNA鉴定 载体特性 间接筛选,-葡糖苷酸酶检测,转化子和重组子,导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞 含有重组DNA分子的转化子 含有目的基因的重组子,ROP,ROI,Sal I,BamH I,Tc,Pvu I,Pst I,EcoR I,Cla I,Hind III,Hind II,Bal I,Ap,r,pBR322,4363 bp,ori,转化子/非 重组子/非,6.3.1 遗传学检测法,1. 抗药性筛选法,基本操作,转化液涂平板 重组子: Apr Tcs 非重子: Apr Tcr,Ap,Ap + Tc,影印,挑选,环丝氨酸的富集作用,Tc抑制Tcs生长, 不致死 环Ser杀死分裂细胞 转化菌Cs +TcTcs被富集离心去TcAp平板Apr Tcs,转化子/非,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,Ap + X-gal,重组子 Apr + lacZ-,2. 显色筛选法,重组子/非,Plac,lacZ ,MCS,a,X-gal,N端lacZ,F lacZM15C端,lacZ显色原理,-互补,基因内互补 肽 + 片段蓝色 无互补白色,E.c: trp; 哺乳类: tk,dCDP,dTDP,dTTP,TR,dTMP,dTDP,dTTP,APT,TK,3. 营养缺陷型筛选法,全合成途径,应急途径,6.3.2 分子杂交检测,菌落原位杂交 dot blot Southern blot Northern blot,1. 菌落原位杂交,影印,变性 中和 杂交 感光,洗涤,杂交,感光,2 斑点杂交,3. Southern & Northern blot,片段大小 基因鉴定 基因转录 表达调控,凝胶电泳法 酶切图谱法 RF与分子大小 快捷、易行 多转化子检测,6.3.3 物理检测法,区分目的重组子,E + B酶切 3 + 3.7 kb 或 1 + 5.7 kb P + B酶切 3.2 kb + 3.5 或 0.8 kb + 5.9,B,B,E,P,4 kb,1 kb,0.8 kb,酶解图谱分析,E酶: 2和2.7 kb,2.7 kb,2.0 kb,B,B,E,4 kb,2 kb,2 kb,E,酶解图谱分析,B全: 0.6 0.8 1.8 3.4 kb B + E: 0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 B部分: 1.4 2.6 4.0 kb,6.3.4 免疫化学检测法,放射免疫原位杂交 免疫沉淀检测 Western blot,1. 放射免疫原位杂交,影印,I125 IgG,感光,复制平板 喷氯仿 IgG