抗体制药.ppt

抗体制药,第一节 概述,1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、球蛋白，并证明抗体活性主要存在于球蛋白组分。,抗体是指能与相应抗 原特异性结合具有免疫功 能的球蛋白。 抗体的产生：机体免 疫系统受抗原刺激后，B 淋巴细胞被活化增殖和分 化为浆细胞，由浆细胞合 成和分泌的球蛋白。,抗体攻击病毒,凝集细菌,免疫球蛋白的发现 20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白，统称为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念。所有抗体是Ig，但并非所有Ig分子都有抗体活性。,注射抗原 IgM IgG（10d，IgM）,初级免疫反应,5类在结构和功能上不同的Ig,由长寿的T细胞和B细胞记忆,IgA：唾液、肺、肠道等的分泌液。,IgE：存在于已结合抗原的组织中。,IgD：成熟的B淋巴细胞表面。, 至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物 有76种，其中抗体药物有15种。 2019年治疗用单抗销售总额已超过52亿美元。 2019年约有50-60个治疗性单抗上市。 2019年预计单抗销售额200亿美元。 美国已占全球单抗市场90%一支独秀。 完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段。,抗体药物,Antigenic determinant,抗原決定基（簇）, 一个抗原分子上可能有数个抗原決定基, 每个抗原決定基至少诱生一种专一性抗体, 蛋白质性抗原決定基：含有六个以上氨基酸,整体水平抗体生成技术,细胞工程抗体生成技术,基因工程抗体生成技术,多克隆抗体（抗血清）,单克隆抗体,嵌合抗体、改形抗体,“小型化抗体”（单链抗体）,组合抗体库技术,噬菌体抗体库技术,Ig基因转基因小鼠,抗体真核表达技术,多克隆抗体（polyclonal antibody） 指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。 实际意义： （1）预防、治疗感染性疾病 如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风； 胎盘球蛋白 抗病毒感染等； 副作用： 超敏反应 （2）临床诊断 如：肥达氏反应伤寒、副伤寒 缺点：特异性差，易出现非特异性交叉反应。,超敏反应（hypersensitivity ）,异常的、过高的免疫应答。即机体与抗原性物质在一定条件下相互作用，产生致敏淋巴细胞或特异性抗体，如与再次进入的抗原结合，可导致机体生理功能紊乱和组织损害的免疫病理反应，又称变态反应。引起超敏反应的抗原性物质可以是完全抗原（异种动物血清、组织细胞、微生物、寄生虫、植物花粉、兽类皮毛等），也可以是半抗原（如青霉素、磺胺、非那西汀等药物，或生漆等低分子物质）。,各种类型的超敏反应,型超敏反应：主要疾病有：全身性过敏反应、皮肤超敏反应、消化道超敏反应、呼吸道超敏反应。 型超敏反应：主要引起的疾病有：输血反应、新生儿溶血症、免疫性血细胞减少症。 超敏反应：引起的疾病有:血清病、感染后肾小球肾炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、过敏性休克样反应、毛细支气管炎。 超敏反应：主要临床疾病有结核菌素反应、传染性超敏反应、接触性皮炎、移植排斥反应,传统抗血清,抗 原,免 疫,所有抗体混合,1,2,3,4,脾 脏,淋巴結,B 細胞,抗体,-a,-b,-c,-d,-a -b -c -d,BALB/c,a,b,b,c,d,传统抗体 (抗血清) 是所有抗体的混和,脾脏产生各种 B 細胞,免疫前要先 把抗原作 成乳剂,免疫,抗原,采血后可得传统抗血清,已建立之小鼠 骨髓癌细胞株,由脾脏收集 B 細胞,抗原通常有多个抗原決定基,免疫后 的脾脏,约在两月內 注射五到八次,Ag X,传统抗血清的交叉反应,专一性反应,沒有反應,交叉反应,+,-,?,1 2 3 Ag A,x y z Ag B,1 2 0 Ag A,单克隆抗体的特点 高度特异性 均一性 来源稳定 可大量生产,1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）。,可生产有用抗体的 淋巴細胞 若与 癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。,癌细胞 可培养生长,浆细胞 B cell 可分泌抗体,融合瘤 Hybridoma,细 胞 融 合,两组染色体混在一起,也可以培养生長 产生专一性抗体,一個 B cell 只 产生一种抗体, 一个 B 细胞只能生产一种抗体，对付某一 抗原決定基。, 若有许多抗原決定基，则需许多株 B 細胞分別生产许多抗体。,B,B,B,Y,Y,Y,Y,抗 原,B,Y,B,亲和力成熟,1,1,2,3,4,抗原決定基,单克隆抗体的应用 作为抗体制剂，用于疾病的诊断和治疗。 检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。 放射性核素标记单抗进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。 CD3单抗作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。 以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗。,McAb在免疫导向疗法中存在的问题 A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗 体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有56h，维持有效药物作用靶组织时间； B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。 需要解决的问题 A、降低McAb的免疫源性； B、降低McAb的相对分子质量。 解决问题的方法或途径基因工程技术 1984年报道了人鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/3。,第二节 单克隆抗体,单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一的B 淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。,一、抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。 为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。,抗原与动物免疫 免疫方法：体内免疫和体外免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原 骨髓瘤细胞系：来自BALB/c小鼠和 Lou大鼠 免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠,白化小鼠原种，命名为BALB/c品系。1985年我国从美国引进到中国医学科学院实验动物研究所，为BALB/c第180代。毛色：白化。 主要特性：乳腺肿瘤自然发生率低。易患慢性肺炎。对放射线甚为敏感。与其他近交系相比，肝、脾与体重的比值较大。有自发高血压症，老年鼠心脏有病变，雌雄鼠均有动脉硬化。对鼠伤寒沙门氏菌补体敏感，对麻疹病毒中度敏感。对利什曼原虫属、立克次氏体和百日咳组织胺易感因子敏感。 主要用途：广泛地应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学研究，以及单克隆抗体的制备等。,BALB/c小鼠,体内免疫法 适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用812周龄雌性鼠。 颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107个细胞进行初次免疫，间隔13周，再追加免疫12次。 可溶性抗原按每只小鼠10100g抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔24周，再用不加佐剂原抗原追加免疫12次。一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原。刺激B细胞分裂。,脾内免疫法即在麻醉下直接将 0.10.2ml抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶性抗原需10g。,体外免疫法 用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性McAb；免疫源性极弱，易引起免疫抑制。 优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。 操作：用48周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单细 胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5 5g/ml, 在5% CO2、37 下培养4 5天, 再分离脾细胞,进行细胞融合。,二、细胞融合与杂交瘤细胞选择性培养 细胞融合的方法 脾细胞（1108） 骨髓瘤细胞（2107） 混合 PEG(2min) 融合 培养液稀释融合液,聚乙二醇（PEG）：融合剂，相对分子量4000，浓度为50%。 二甲基亚砜（DMSO）：促融剂，增加融合率。,融合率高 自身不分泌抗体 产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强 长期稳定,骨髓瘤细胞的特点,杂交瘤细胞的筛选 细胞融合后可产生多种融合细胞：脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合细胞。 利用HAT选择性培养基进行淘汰： 次氨甲喋呤（ A ）阻断DNA合成，淘汰瘤-瘤细胞和瘤细胞、脾-脾细胞、脾细胞；而脾细胞可利用次黄嘌呤（ H ）和胸腺嘧啶（ T ）合成DNA，使脾-瘤融合细胞得以生长。,三、筛选阳性克隆与克隆化 常用检测方法 免疫酶技术 免疫荧光技术 放射免疫技术,克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。 常用的克隆化方法 有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔 板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。 第一次克隆化时也要应用HT培养液，以 后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培 养液。 软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞 分裂后形成小球样团块，由于培养基是半 固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培 养。,ELISA用于破伤风抗体的筛选,四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 杂交瘤细胞鉴定染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。 小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为6268，NS-1为 5464， 大多数为非整倍性，有中部和亚中 部着丝点。 杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和， 在结构上多数为端着丝粒染色体外， 还应出现少数标志染色体。 染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价 的抗体；反之，则反。,五、单克隆抗体的大量制备 体外培养法：可获的10g/ml抗体 体内诱生法：可获的520mg/ml抗体 降植烷 BALB/c小鼠 接种杂交瘤细胞 取腹水 离心 上清液,六、单克隆抗体的纯化 根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。 体外诊断试剂IgG类沉淀处理+亲和层析 IgM类沉淀处理+凝胶过滤 体内诊断试剂或治疗用药亲和层析+阴离子交 换层析。注意除去毒 素、病毒、核酸等微 量的污染物。,动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序 （1）澄清和沉淀处理： 1000g 离心5min，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和脂质） 20 000g 高速离心30min ,去除残留的小颗粒物质 用0.2 m微孔滤膜过滤，去除细菌、支原体 饱和硫酸铵沉淀抗体（50%饱和硫酸铵能回收90%以上的抗体）。,动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序 （2）分离 A、凝胶过滤：用于IgG和IgM类。常用SephadexG200 为 分离介质，收集到3个峰，最高峰为IgM，另外两个峰为 IgG。 抗体回收率达5080%，能去除微量杂蛋白，纯度达95%以上。 B、阴粒子交换层析：用于IgG类。在pH7.4条件下，IgG1 和IgG2能结合在DEAE填料上，其中IgG2a可在较低粒子强度 下洗脱下来，其纯度很高。 IgG2b和IgG3在低离子强度下易 发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。 C、亲和层析：多用蛋白A亲和层析，适用于IgG类。鼠源 性单抗在 pH8.0时，IgG2b、IgG3几乎全部结合在蛋白 A柱上， IgG1稍差，用 pH3.5缓冲液可洗脱 IgG2b，pH4.0缓冲液可洗 脱下IgG3，pH4.5缓冲液可洗脱IgG2a， pH6.0可洗脱IgG1。收 获的抗体纯度很高，但也有极微量的杂蛋白。,第三节 鼠源性单克隆抗体 的改造,杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。 目的：降低免疫原性；降低相对分子量，增加组织通透性。,Ig分子结构,原理：抗体同抗原结 合的功能决定于抗体 分子的可变区（V）， 同种性免疫原性则决 定于抗体分子的稳定 区（C）。,1个Fab片段,1个Fc片段,Ig分子的基因结构,一、人鼠嵌合抗体（chimeric antibody）,在基因水平上将鼠源单抗的可变区（V）与 人抗体的稳定区（C）融合而得到的抗体。,构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体稳定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。,构建重组表达载体,克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。 人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。,人-鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，加强ADCC效应。目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。,ADCC效应,即抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。其机制为靶细胞膜抗原与特异性IgG类抗体结合形成免疫复合物后，IgG抗体的Fc段与效应细胞(如NK细胞、巨噬细胞)上的Fc受体结合，使效应细胞活化，产生对靶细胞的杀伤作用。,鼠单抗可变区的人源化,尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。,二、改形抗体（CDR移植抗体） ( Reshaping antibody ),Ig 分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。 用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig 分子中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。,三、小分子抗体,基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的V区片段，相对分子量为原抗体的1/801/3。即保留CDR区，而Ig 分子中的C区不表达。 小分子抗体类型有 Fab片段抗体： VH+CH1 Fv抗体： VH+VL 单链抗体： VH-Linker-VL 单域抗体：VH或VL 最小识别单位（MRU）,小分子抗体的优点 可以用细菌发酵生产，成本低; 分子小，穿透力强; 不含Fc，没有Fc带来的效应; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。,Fv,ScFv,单区抗体,最小识别单位,Fab,由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽作用下，Fab进入质周腔，装配折叠后具有结合抗原的活性。,（1）Fab （VH+CH1 ）,Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。,（2）Fv（VH+VL）或 ScFv,Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。 在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。 连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。,单链抗体大多在大肠杆菌中表达 直接在细胞质中表达； 与其它菌体融合表达融合蛋白； 分泌表达具有功能的单链抗体。,即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。,（3）单域抗体（VH或VL ）,VH,约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。,（4）最小识别单位（MRU）,四、双功能抗体,即双特异性抗体（BsAb）。它是一种非天然性抗体。其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。,双特异性抗体是指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原，另1种为对应效应成分。 即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞，将效应细胞富集在肿瘤周围，而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合，激活效应细胞，实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。,双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比，除了能特异性识别肿瘤细胞外，还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处，从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强，发挥免疫导向作用，这是肿瘤治疗的新突破。,多价小分子抗体,五、抗体融合蛋白,从广义讲应属于双功能抗体范畴。类型： （1）配基配基型融合蛋白，如 CD4-Fc （2）配基Ig型嵌合抗体，如 IL-2-Ig （3）配基FV型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 （4）受体FV型融合蛋白 （5）酶抗体型融合蛋白（abeneyme，抗体酶）,第四节 基因工程抗体和抗体工程,抗体研究的三个阶段：以1890年Behring发现白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体；以1975年Khler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表；以1994年Winter以基因工程方法制备抗体为代表。通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体，在此基础上发展成抗体工程。他创建了噬菌体抗体库技术，克服了人体不能随意免疫的缺点，用人外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体。,抗体库技术,抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。,一、噬菌体抗体库技术的基本方法,1.获取目的基因 提取RNA，经RT-PCR获取抗体某一特定基因区段。 2.抗体库技术的载体 普遍使用噬菌粒（phagemid）载体。 3.淘筛（panning） 用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，淘汰非目的克 隆，使目的克隆大量扩增。 4.表达与鉴定 目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性 表达，其产物用Western blot分析确定后，就完成了全过程。,RT-PCR,将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。,噬菌体抗体库的“吸附一洗脱一扩增”富集性选择过程,二、噬菌体抗体库技术的特点,1.模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容，能包含B细胞全部 克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴 细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，是人体多克隆 细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的 种属普遍性。VH和VL基因的随机重组增加了抗体的多样性。 2.避开了人工免疫和杂交瘤技术 由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出 任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用 人工免疫动物和细胞融合技术。 3.可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因的随机重组模拟 了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体， 因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。,三、基因工程抗体的表达,1.原核细胞表达 2.真核细胞表达 酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞、真菌等。 3.转基因植物表达 烟草叶和拟南芥植物。其产量可达叶片总蛋白 量的1.3%。 4.转基因动物表达 单基因水平上做转基因鼠。,第五节 抗体诊断试剂,抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某种反应。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故抗体类药物可用于治疗。在体外，由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集或沉淀等可见反应，故可用已知抗体来鉴定抗原；做病原学诊断和血型测定，称为血清学鉴定。抗体诊断药物基本分为三类：血清学鉴定用的和免疫标记技术用的抗体制剂，以及体内导向诊断药物。,一、血清学鉴定用的抗体类试剂,1.鉴定病原菌用的抗体试剂 （1）常用诊断血清的品种和用途 见书 162页表46。,1.鉴定病原菌用的抗体试剂 （2）诊断血清的制备步骤 a、制备细菌抗原 细菌接种培养收集菌苔制成菌液 b、免疫动物和制备抗体血清 动物：家兔、马、羊、豚鼠。 免疫途径：静脉、腹腔、皮下。 接种次数37次，每次间隔34d，末次注射后68d取 血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。 c、诊断血清的诊断方法 直接凝集反应。,豚鼠,2.乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被动血凝诊断试剂,（1）试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗HBs血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。 （2）制备步骤：先用HBsAg免疫豚鼠获得抗HBs血清硫酸铵盐析/柱层析取其IgG在pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。 （3）诊断方法：在V型血凝板上进行，阴性样品不凝集，许血细胞沉积于V型孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集成块状。,3.妊娠诊断试剂 妇女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在3个月内可达到高峰。此时检测尿液中的HCG，就可确定是否怀孕。,HCG（人绒毛膜促性腺激素）是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由a-和b-两个亚单位构成。,正常参考值 妊娠周数 HCG（IU/L） 1-2周 50-500 2-3周 100-5000 3-4周 500-10000 4-5周 1000-50000 5-6周 10000-100000 6-8周 15000-200000 2-3月 10000-100000,4.抗ABO血型系统血清,原理：血清学方法检测ABO血型是根据抗原、抗体相互作用的原理，检出能产生抗体的血型抗原。 方法：向新鲜血液中加入抗A，抗B，抗O标准血清，离心、振荡、静置。细胞沉积在底部（阳性），不凝集孔细胞呈悬浮状态（阴性）。,二、免疫标记技术用的抗体类试剂,给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外，还能为探讨发病机制提供手段。,1.荧光抗体诊断试剂 荧光抗体是用荧光色素，如异硫氰酸荧光素 （FITC）、罗丹明（RB200）、藻红素（PE）等 标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含 有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原 结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达 到诊断和定位的目的。,二、免疫标记技术用的抗体类试剂,2.免疫酶抗体诊断试剂（酶标诊断试剂） a、HBsAg（乙型肝炎表面抗原）酶标诊断试剂 b、HBeAg（乙型肝炎e抗原）酶标诊断试剂 c、HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶标诊断试剂 d、测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂 e、AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂 f、CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂,二、免疫标记技术用的抗体类试剂,酶联免疫吸附测定原理 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 上发展起来的一种新型免疫测定技术，ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算