微生物培养检验技术.ppt

第十章 微生物学培养检验技术,样品的采集 采样：指从待检物中采取少量具代表性的样品供分析检验用。 一、采样要求 1、采样前，准备好灭菌的容器及采样工具。 2、无菌采样 3、用无菌纸袋或玻璃器皿存放样品 4、样品及时封口，并做好记录 5、及时送检,二、采集方法 1、面包、糕点、方便食品 采集方法：取原包装，用无菌镊子夹下包装纸采取外部及中心部位检样共200g，带馅糕点直接采取外皮与内陷25g。 检样处理：无菌称检样25g，加入225ml无菌生理盐水中制成菌悬液。 2、豆制品 样品采集：采取接触盛器边缘、底部及上面不同部位样品200g放入灭菌容器内。 检样处理：无菌称样25g，放入225ml无菌水中混匀。,3、乳及乳制品 （1）样品采集 散装或大型包装：用灭菌刀、勺取样，每件不少于200g，及时送检。 大型包装：采用整件原包装，每件样品采集量为瓶装：1瓶 袋装：1袋 罐装：1罐 (2）检样处理 鲜奶、酸奶：无菌手续去纸盖，瓶口火焰消毒后无菌吸取25ml放入225ml无菌生理盐水中混匀。 炼乳：将瓶或罐用温水洗净，用点燃的酒精棉球消毒，无菌开罐器开瓶后，无菌称25g(ml)放入225ml无菌生理盐水中混匀。,奶油：无菌开包，取适量于灭菌瓶内,45水浴溶解（温箱），立即吸25ml225ml生理盐水中十倍稀释（45水溶中保温）。从检样融化到接种完毕不应超过30分钟。 奶粉：罐装的同炼乳。袋装的用75%酒精棉球涂擦消毒袋口，无菌开封取样25g，放入含玻珠的瓶中,将225ml温热生理盐水徐徐加入，防结块。 奶酪：用灭菌刀削去部分表面封蜡，再用点燃的酒精棉球消毒表面后，用灭菌刀切开后，用无菌刀取表层及深层检样少许，置灭菌乳钵内捣碎，加少许生理盐水调成糊状。,4、蛋及蛋制品 （1）样品采集 鲜蛋：用流水冲洗外壳，再用95%酒精棉球涂擦消毒后，放入灭菌袋内，加封作好标记送检。 全蛋粉、蛋黄粉、蛋白片：将包装开口处用75%酒精棉球消毒再开盖，用灭菌的金属制双层螺旋式套管采样器斜角插入箱底，使套管旋转收取检样，提出箱外用灭菌小匙自上、中、下部取样，装入灭菌广口瓶中，每个检样不少于100克。 （2）检样处理鲜蛋外壳：用无菌生理盐水浸湿的棉拭充分擦试蛋壳，将棉拭直接放入培养基内增菌培养。,将整只鲜蛋用无菌水擦洗，以擦洗液作检样。 鲜蛋蛋液：蛋壳流水下洗净75%酒精消毒壳打蛋 蛋粉：装样瓶浸入流动冷水中，检样融化后取出放入有玻珠的瓶中。 5、肉及肉制品 肉类包括鲜肉、冻肉、肉馅、禽肉等，肉制品指火腿、香肠等。,（1）样品采集 生肉：宰后用无菌刀取两腿内侧肌肉各500克或劈半后两侧背最长肌各50克，立即送检。 家禽：用灭菌棉拭采胸腹各10cm2，背10cm2，四边各5cm2 其他熟制品：一般采200克。 （2）检样处理 生肉：表面消毒（沸水内烫34秒或烧灼消毒）无菌剪取检样深层肌肉25克灭菌乳钵内剪碎无菌玻璃砂研磨加灭菌水225ml 熟肉、灌肠、肉松：直接称25克放入灭菌乳钵内无菌剪碎研磨加225ml无菌水 棉拭液：凡用棉拭采取的检样作原液，摇匀后10倍稀释,6、调味品 （1）样品采集 酱油、食醋：瓶装 采取1瓶 散装 无菌吸500ml 酱类 用灭菌勺子取500g 味精 采取一袋100g （2）检样处理 瓶装：酒精棉球消毒瓶口石碳酸纱布盖好灭菌开瓶器开启检验 散装：直接吸取接种 酱类：无菌称25g225ml无菌水,7、冷食品 （1）样品采集 冷食菜：将样品混匀，采样200g 瓶装饮料：两瓶为一件 散装采500ml 冰淇凌：4杯为一件 散装采200g，放瓶内冷藏或隔热容器中 食用冰块：食用冰块取500g （2）检样处理 冷食菜：25g+225ml无菌水中 瓶装饮料：点燃酒精棉球烧瓶口石碳酸纱布盖好无菌开盖,样品的微生物检测方法 一、感官检验 1、色泽 微生物菌体本身的颜色。 微生物分泌的色素。 微生物的代谢产物促使食品发生化学变化。 2、气味 不正常的气味产生，如霉味臭、乙酸臭、胺臭、粪便臭、硫化氢臭、酯臭等 。 3、口味 从口味的改变上反映出来如 酸味、苦味及其它异味。 4、组织状态 固体食品：变形、软化、发粘、结块、湿润。例如鱼肉因微生物作用使组织细胞破坏，细胞内容物外溢而呈现肌肉松驰、弹性差，有时表面发粘。 液体食品：浑浊、沉淀、浮膜、变稠、产气。,二、样品的微生物镜检 直接对样品进行镜检。 三、培养检验 （一）培养基的选择 细菌 肉汤蛋白胨培养基 酵母 用酵母菌培养基 霉菌 用霉菌培养基并加入细菌抑制剂（孟加拉红70mg/100ml或链霉素4000g/100ml） 放线菌 用高氏一号培养基,（二）培养检验方法 1、种植培养 （1）方法：适用于粒状或块状试样的全菌和内部菌分析 直接种植培养 适于全菌分析。样品不做任何处理，直接点植于平板培养基上。 表面消毒种植培养 适于样品的内部菌分析。,（2）注意事项 用无菌镊子夹取样品均匀种植在培养皿上，微压。 种植数 9-11cm培养皿 5点或10点 块将样品切成1cm20.1-0.5cm,每皿3-5块 贴标签，注明样品名称、日期、分析方法、培养 细菌 32 12天；霉菌28 57天 结果分析 计算菌的检出率； 某菌检出率=检出某菌的点数/种植培养总点数 记录培养特征； 镜检形态特征,2、稀释培养 适用于菌量分析：外部菌、内部菌及全菌 （1）方法 洗涤稀释 适于粒状或块状样品外部菌分析 混合稀释 适于粉状或流体试样的全菌分析 捣碎稀释 用组织捣碎器或研钵将定量无菌水捣碎，试样经表面消毒后也可作内部菌分析。 （2）菌落计数 菌落计数时限 细菌 定温培养12天 酵母 23天 霉菌 57天,稀释度选择 试用三个连续稀释度，每稀释度做24套平行平板。 一般试样：细菌检测用10-2、10-3、10-4 真菌检测用10-1、10-2、10-3 计数平板选择 选用同一稀释度各皿的平均菌落数，细菌30300间，真菌10100间。 报告 含菌量（单位重量或体积）=平均菌落数稀释倍数取样量（采用二位有效数字）,样品的微生物学检验项目 一、细菌学检验 （一）细菌总数的检测 细菌总数：指单位样品（重量、体积、面积）中所含的细菌总数（杂菌数） 1、细菌总数的意义 常作判定样品被微生物污染程度的指标。 预测样品耐存放的程度和期限。 细菌越多，菌相越复杂，污染致病菌的机会越多。 2、细菌总数的检测方法 检样称取（25克+225ml+玻珠）稀释（十倍稀释）平皿滴加（选用三个连续的稀释度）培养基的平皿倾注（45-5010-15ml）培养（37倒置24-48小时）菌落计数报告,（二）大肠菌群及其卫生学意义 大肠菌群指一群37下24小时内能发酵乳糖产酸产气、好氧或兼性好氧的G（-）无芽孢短杆菌。 卫生学意义 作为理想的粪便污染指示菌，它具备 A肠道内特有，显示指示特性 B肠道内数量大，易检出 C肠外环境中抵抗力强 D少量存在也能检出 2、检验方法 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查表报告大肠菌群的近似数MPN(100ml或100克样品中Most probable Number) EMB平板上大肠菌群菌落特征：深紫黑色、黑紫色、淡紫红色。,（三）致病性细菌的检测 主要指一些能引起人类食物中毒的细菌，主要有：沙门氏菌、大肠菌、肉毒梭菌、葡萄球菌。食品卫生法中规定，这四种致病菌不得有检出。 目前，对样品中病原菌进行检验还存在一定的局限性。因借一种或少数几种检验方法无法将多种病原菌全部检出，而采用较多的检验方法在实际工作中又不现实。同时样品种类多，所处的环境条件不一，污染致病菌的种类和数量也不一样。但多数情况下，污染的病原菌数量不会太多（对环境的抵抗力弱），一般检验难以检出，故进行致病菌检验时只能根据食品的特点选一些致病菌作重点检测对象。 如：蛋粉、肉制品、冻肉禽类常确定沙门氏菌 牛奶、罐藏食品常选肉毒杆菌。,二、真菌学检验 （一）霉菌的测定 1、稀释培养法 测全菌 固样捣碎稀释 粉样、流体样混合稀释 2、显微镜直接镜检法 血球计数器计数法 视野计数法 吸管、载片、盖玻等彻底消毒，用吸管准确测出1ml菌液的滴数，并滴一滴于载玻片上，盖盖玻片（菌液不外溢或发生气泡），在显微镜下按下列顺序检视10个视野，记录每个视野菌数，求出平均数，再用测微尺测定视野直径，求出视野面积，同时算出盖玻片面积，则： 每克样品带菌量=C/R.M.L.D/W,(二）酵母菌总数的测定 1、稀释法 混合稀释、捣碎稀释 2、镜检法 血球计数板计数