基因工程所需的基本条件.ppt

,第三章 基因工程的基本条件,基本条件： 用于核酸操作的工具酶 用于基因克隆的载体 用于基因转移的受体菌或细胞,一、限制性核酸内切酶,是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（回文序列，48bp），并切割DNA双链的核酸内切酶。,1.定义,第一节 限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease ）,2.来源：原核生物，主要是细菌,3.性质,内切酶,4.功能,自我保护作用,细菌的限制和修饰系统（R/M体系）,限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。,（1）限制（Restriction）,（2）修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,二、限制性内切酶的类型,I 型限制性内切酶,目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。,II 类限制性内切酶,III类限制性内切酶,首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的，如 EcoB和 EcoK。,（1）酶结构,1. I型限制性内切酶(1%),是三亚基双功能酶，包括 R:限制酶亚基 M:甲基化酶亚基 S:识别DNA序列亚基,切割位点在识别位点1000 bp以外，无特异性,Recognize site,cut,1-1.5kb,（2）切割位点,首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。,2. II类限制性内切酶( 93%),（1）酶结构,修饰和限制活性由分开的两个酶(甲基化酶和限制性内切酶)来完成，其中甲基化酶由一条肽链构成，限制酶由相反方向结合的同源二聚体构成。,（2）识别序列,DNA双链上的回文对称序列（旋转对称序列，反向重复序列），一般长4-8bp ，与DNA的来源无关。,EcoR I： 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5,EcoR V,（3）切割位点,识别位点处切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或平末端（blunt end）。,几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点,（4）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）,含有几个核苷酸单链的末端,分两种类型：, 5端凸出（如EcoR I切点）,GAATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoRI 37 ,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,Pst I等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37 ,粘性末端促进连接便利,i）不同的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii）同一个DNA分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,识别相同序列的限制性内切酶称同裂酶。,（5）同裂酶（Isoschizomers),同序同切酶（完全同裂酶）：,识别位点和切点完全相同。 如Hind 和Hsu I。,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5,识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。, 同序异切酶（不完全同裂酶）：,识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等,（6）同尾酶(Isocaudamers）,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl ,5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5,Xho ,U代表嘌呤；Y代表嘧啶。,5-GATC-3 3-CTAG-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。,5-G 3-CCTAG,GATCT-3 A-5,BamH I,Bgl ,5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl ,Sau 3A,（7）DNA末端长度对限制酶切割的影响,（8）酶切反应条件,缓冲液：MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等： 有助于酶的稳定 反应温度：大多数为37 反应时间：通常1h,许多酶延长反应时间可减少酶量。 终止酶切的方法： a、10mM/LEDTA b、加热，大多数酶可用65 温育5分钟失活。 C、苯酚抽提蛋白，然后用乙醇沉淀DNA。,一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，50L反应体系中完全降解1 g DNA所需要的酶量。 影响酶活性的因素很多，最重要的有： A DNA的纯度和甲基化程度 B 甘油的含量（不超过5%） C 反应体系中的离子强度 D 反应体系的pH值 F 反应的温度条件 （通常为37 ）,Buffer (10X) 2.0 L Water 16.5 L DNA 1.0 L Enzyme 0.5 L Volume 20.0 L,酶单位的定义和影响酶活性的因素,酶 切 反 应 的 基 本 步 骤,电泳,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,酶量的确定： 2-3 倍才能保证完全消化；,（10）双酶切反应,1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切 2）对盐浓度要求不同的酶，也可采取同步双酶切：选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。 3）如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。,3. III类限制性内切酶（1%）,二亚基双功能酶，在切割位点下游24-26bp处，反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 在基因工程操作中用途不大。,1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：,三、限制性内切酶的命名,1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。,大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。,2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoR I）。 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。,DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。,1. DNA的纯度,四、影响限制性内切酶活性的因素,纯化DNA ，比如用2.5倍体积的冰冷乙醇沉淀 加大酶的用量 延长保温时间 扩大反应体积（ 20l）,一般采取,大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：,2. DNA的甲基化程度,dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株！,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 度，少数要求40-65 度。,3. 温度,是影响限制酶活性的重要因素。,4. 缓冲液(Buffer),缓冲液的化学组成,MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,第二节 基因工程中常用的DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow 片段 3. T4 噬菌体DNA聚合酶 4. T7 噬菌体DNA聚合酶 5. 反转录酶 6.末端转移酶,1. 共同特点,把dNTPs连续地加到引物的3OH端。,2. 主要区别,T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。,其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。,常用的DNA聚合酶的特点,持续合成能力和外切酶活性不同。,1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I,（1）大肠杆菌DNA聚合酶I的性质,一条单链多肽。, 3 5外切酶活性。,53 DNA聚合酶活性。,53外切酶活性，位于N端，用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的53外切酶活性部分，就成为Klenow fragment。, 底物：,dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）, Mg2+, 带有3OH游离端的引物, DNA模板,（2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件,-OH,5,3,dNTPs,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,（3）DNA聚合酶I（DNA Pol I）基本用途：制备32P标记的探针,DNAase I,DNA Pol I,Mg2+ 5 dNTP 5 ppp dA（a-32P-dATP）,DNAase I：为一内切核酸酶，它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA，形成单链切口,2. Klenow fragment,具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。,（1）Klenow fragment的性质,DNA Pol I Klenow fragment (76KD）,枯草杆菌蛋白酶, 3端补平,5,5,klenow, DNA 3末端标记,补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。,在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。,klenow,（2）主要用途,3隐蔽末端的DNA片断,Klenow fragment补平,根据末端的顺序选择一种 -32P-dNTPs,末端标记的DNA,限制性内切酶切,5-G3 3-CTTAA5,5-GAA3 3-CTTAA5,5-GAATT3 3-CTTAA5,5-G3 3-CCTAG5,5-GG3 3-CCTAG5,5-GGATC3 3-CCTAG5,EcoR I,BamH I,-32P-dATP,-32P-dGTP,25oC 1h,（1） T4 DNA聚合酶的性质,3. T4 DNA聚合酶,从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。有53聚合酶活性和35外切酶活性（约为Klenow 片段活性的200倍）。,用35外切酶活性作用于末端制造出3隐蔽端。再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。,5,5,3,3,5,5,3,3,T4 DNA聚合酶,无dNTPs,T4 DNA聚合酶,有dNTPs,5,5,当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。 当有dNTP时， T4DNA聚合酶行使53聚合酶功能，填平3隐蔽端。,5. 逆转录酶,逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶），来源于RNA肿瘤病毒,最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV） 作用：以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合），合成cDNA,AAAAA,TTTTT,5,3,mRNA 5,cDNA,不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Mg2+ dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAA OH3,p 5,6.末端转移酶 来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。可在cDNA或载体的3末端加同聚物尾巴，便于克隆。,一、连接酶,1. 两种DNA连接酶,（1）大肠杆菌连接酶:只能连接粘性末端。 （2）T4噬菌体的连接酶:不但能连接粘性末端,还能连接齐平末端。 2. 连接条件 （1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA3端有游离的-OH,5端有一个磷酸基团。 （3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP ;大肠杆菌中: NAD+,第三节 其它分子克隆工具酶,OH,P,3、功能： （1）修复DNA链上切口处的磷酸二酯键：,T4-DNA连接酶,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,nick,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,（2）连接多个平头双链DNA分子：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,4、 连接反应的温度,最佳温度：连接酶反应的最佳温度是37C。 实用温度：在37下粘性末端的结合很不稳定，所以一般采用 416 C。 插入片段与载体的浓度比例： 1020倍（摩尔之比） 目的：增加插入片段与载体的接触机会，减少载 体自我连接的现象。,DNA连接酶,DNA连接酶的反应条件,Tris-HCl,50 - 100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5 - 1 mM,DTT,5 mM,Volume,10 - 20 ul,4 - 15 4 - 16 hr,1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下16 反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量,二、碱性磷酸酶,1. 碱性磷酸酶种类,从大肠杆菌中分离出来，具有抗热性。,Bacterial alkaline phosphatase，BAP,（1）细菌性碱性磷酸酶,（2）小牛肠碱性磷酸酶,Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP,从小牛肠中纯化出来，SDS中加热68oC可完全失活。,2. 碱性磷酸酶的特性,催化脱掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,碱性磷酸酶,3. 碱性磷酸酶的功能,（1）防止线性化的载体分子自我连接,单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。,AAGCTT TTCGAA,Hind酶切,A-OH TTCGA-P,P-AGCTT HO-A,碱性磷酸酶,5,5,5,A-OH TTCGA-OH,HO-AGCTT HO-A,OH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。,但同一酶切后的外源DNA的5端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。,A TTCGA,AGCTT A,AGCTT,A,A,TTCGA,连接酶,-OH与-OH连不住,其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。,3,P-AGCTT,A-OH,5,3,HO-A,TTCGA-P,5,外源DNA,四、核酸酶,1、单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）,大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+,ExoVII,3,5,3,5,3,5,3,5,2、双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）,ExoIII,3,5,3,5,Mg2+,3,5,3,5,大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3 端外切,3、双链核酸外切酶：l 核酸外切酶（ lExo）,lExo,3,5,3,5,Mg2+,l核酸外切酶特异性地从5 端外切,3,5,3,5,4、单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae）,Zn2+必需,最适pH范围为4.0 - 4.3,需要NaCl 10 - 300 mM,降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍,降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍,1）S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,5 G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 3,5 dNMPs 或 5 NMPs,2）S1核酸酶的基本反应：内切带切口或缺刻的双链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A 5,nick,gap,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G,3 C-G-A-G-T-C,T-G-G-A-G-T 3,A-C-C-T-C-A 5,S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1 mapping）,DNA,mRNA,杂交,S1,EcoRI,基因工程操作过程,第四节 用于基因克隆的载体,载体的功能及特征 质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 人造染色体载体,一、载体的功能及特征,1、定义：把目的基因通过运载工具送到受体细胞内，这种运载工具就叫载体（vector)。 2、载体的特征: 1）在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制起点） 2）具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，供外源DNA片断插入，同时不影响复制 3）有一定的选择标记，用于筛选,3、载体的种类 质粒载体（plasmid） 噬菌体载体（phage） 动物病毒（virus） 噬菌粒载体 考斯质粒（cosmid） 人造染色体（artifical chromosome）,二、质粒载体,质粒（plasmid）：独立于染色体以外的能自主复制的双链、共价、闭合、环状DNA分子。,质粒存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。 细菌的大质粒可含几百个基因，小质粒仅含2030个基因。,致育质粒，F质粒（fertility plasmid），编码有性生殖功能，带有F质粒的细菌为雄性菌，能长出性菌毛，无F质粒的细菌为雌性菌，无性菌毛。,耐药性质粒编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性，耐药性质粒分为二类，其中可以通过细菌间的接合进行传递的称接合性耐药质粒，又称R质粒(resistance plasmid)。另一类是不能通过接合传递的非接合性耐药质粒，但它可通过噬菌体传递。,细菌粘附定植在肠粘膜表面是由K质粒决定的。,细菌素质粒编码各种细菌产生细菌素，如Col质粒编码大肠杆菌素，对同品系或近缘的细菌具有抑制作用，实际是对产生细菌素细菌本身起保护作用。,代谢质粒编码产生相关的代谢酶，如沙门菌发酵乳糖的能力通常是由质粒决定的。,细菌携带有哪种质粒，则有相应的功能，但也有某种质粒可同时决定几种功能，如F质粒除有致育性功能外，还能提供辅助质粒转移的能力，某些耐药性质粒上还带有编码毒力的基因，故带此种质粒的细菌，不仅获得了耐药性，而且致病性也得到了增强。,毒力质粒或Vi质粒（virulence plasmid）编码与该菌致病性有关的毒力因子。,1.质粒的空间构型：, 共价闭合环状DNA（ Covalent close circular DNA， cccDNA)，呈超螺旋（super coil ，SC ） 开环DNA（ open circular， ocDNA），一条链上有一至数个缺口。 线形DNA （ linear ，lDNA）,DNA超螺旋结构,质粒空间构型与电泳速率：同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同， scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。,SC,OC,L,2、质粒的基本性质,1）质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型。 严紧型质粒（stringent plasmid）拷贝数少，大约有1-几个拷贝。 松弛型质粒（relaxed plasmid）拷贝数多，有1060份拷贝。,ori,rop,（+）,Rop,3,5,5,3,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,RNA II,RNA I,复制方向,E.coli ColE1 plasmid,控制复制引物与模板的结合,在复制时，首先合成前 RNA ，即前引物，并与 DNA 形成杂交体；而后 RNase H 切割前 RNA ，使之成为成熟的 RNA ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。形成的 RNA 可控制RNA 形成二级结构，同时 Rop 增强 RNA 的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱 RNA 和 RNA 之间相互作用的突变，将增加带有 ColE1复制子的拷贝数。,Rep,Cop,Rep：蛋白启动质粒的复制 Cop：其表达产物可抑制复制作用,从而控制质的拷贝数,控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合,P/Orep,Pcop,cop,rep,ori,2）质粒的不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容； pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容。,质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定。因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，由于竞争作用致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。,在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒:能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），多为低拷贝的大质粒，含有完整的转移操纵子基因（tra）和转移起始位点。能在同种或亲缘关系近的菌体细胞间进行转移。 非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用，多为高拷贝的小质粒，如大肠杆菌的ColE1、RSF1010等。由于缺少转移基因（tra），不能自主转移，但由于含有与F质粒类似的bom位点或诱动基因mob（mobilization），因而能被带有tra基因的转移性质粒诱动而发生转移。,3）质粒的转移性,大肠杆菌接合（conjunction）,F因子：又叫致育因子，在某些大肠杆菌中发现的一种最具代表性的单拷贝的接合型质粒，94kb，总共编码19个转移基因（tra），以三种形式存在。,3、标记基因 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，但是对DNA重组分子的筛选具有重要意义 包括： 物质抗性： 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成： 细菌毒素、天然色素、有机碱,标记基因用途： 1）选择标记基因： 鉴别目的DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。 2）筛选标记基因： 用于将携带了外源DNA片断的重组子挑选出来。,4、质粒载体的种类 1）克隆质粒载体（cloning vector） ： 主要用于扩增或保存DNA片断，其上有复制子，最好是松弛型高拷贝； 2）表达质粒载体（expression vector）： 能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子； 3）穿梭质粒载体（shuttle vector）： 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆。 这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。,1）克隆质粒载体 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的： pSC101 8.8 kb拷贝数5、四环素抗性标记基因 Tetr ColE1 6.5 kb拷贝数20 30、大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RSF2124 ColE1衍生质粒、氨苄青霉素抗性标记基因 Ampr,组成:,它由三部分组成： 来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr 来自RSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。 来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori,常用质粒克隆载体： pBR322，4376bp,特点:,具有多个单一的限制性内切酶位点。 Tetr中有BamH1切点（GGATCC）和Sal切点（GAATTC），Ampr中有Pst切点（CTGCAG）。 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的。,重组克隆的 “插入失活”筛选方法,外源基因插入在Tetr中，基因型为Tets Ampr ； 外源基因插入在Ampr中，基因型为Tetr Ampr； Tetr：在含有四环素培养基可生长；Tets：在含四环素培养基上不生长；Ampr：在含有氨卞青霉素培养基上不生长；Amps：在含有氨卞青霉素培养基上可生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。 这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活（insertional inactivation ）。,常用质粒克隆载体：pUC系列,pUC18/19特点：,具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷贝数。,具有多克隆位点，很方便插入外源基因,可用-互补方法鉴别 含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因,含有氨苄青霉素抗性基因,LacZ: 大肠杆菌的编码-半乳糖苷酶基因，编码1024个氨基酸，切断乳糖的半乳糖苷键产生半乳糖和葡萄糖 LacZ: 编码-半乳糖苷酶N端146个氨基酸 ，这个编码区中插入了一个MCS，但它并不破坏读框，但是，若在该 DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无-互补能力的 -半乳糖苷酶片段 X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷，也是-半乳糖苷酶的一种生色底物，经降解后可生成溴氯吲哚，呈蓝色，也使大肠杆菌菌落从白色转变为蓝色,b,pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,-半乳糖苷酶的-肽段,lacZ,MCS,Plac,突变型lac - E.coli,溴氯吲哚,-互补(Alpha complementation) ： 质粒中插入lac Z基因，编码N端146个氨基酸残基（ -半乳糖苷酶的片段）。突变型lac - E.coli 可表达该酶的片段（酶的C端）。单独存在的及片段均无半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性，使底物X-gal特异性变为蓝色化合物，这就是所谓的 - 互补。,（2）表达质粒 1）大肠杆菌中的表达质粒 包括启动子、操纵位点序列、多克隆位点、转录及翻译信号、质粒复制起点及筛选标记等 2）真核表达质粒 酵母表达质粒 昆虫表达质粒 哺乳动物细胞表达质粒,1）大肠杆菌中的表达质粒,启动子（promoter）：是与基因表达启动相关的顺式作用元件，与RNA聚合酶特异结合，是基因转录的起始部位，分为两类：一类是RNA聚合酶能够直接识别的，另一类在与RNA聚合酶结合时需要蛋白质辅助因子存在。 序列特点： 上游有-10，共同序列TATAAT （Pribnow box）； 上游有-35，共同序列TTGACA,Lac启动子（Plac）：中等强度启动子，一般带有lacZ基因片段，实现-互补。 噬菌体左臂（PL)和右臂启动子（PR) ：是噬菌体早期左臂和右臂转录控制区，启动效率高，广泛使用的原核生物启动子。 Trp启动子（Ptrp）：是强启动子，来源于大肠杆菌色氨酸操纵子， 在富含trp的培养基中处于关闭状态，当trp水平下降，Ptrp开始转录。 T7启动子（PT7）：来自于T7噬菌体晚期转录基因启动子，只能由T7聚合酶识别（其转录活性是大肠杆菌聚合酶6倍，因此PT7转录活性高。,核糖体结合位点（ribosome binding site，RBS）： 大肠杆菌中翻译起始时，首先是核糖体30S小亚基识别并结合至mRNA5端的翻译起始部位，该部位就是RBS。 RBS包括起始密码子ATG序列及其上游SD序列。 SD序列：ATG上游311碱基处的保守序列AGGAG，可与小亚基中16S rRNA 3端富含嘧啶序列互补结合，mRNA必须有这一序列才能进入核糖体。,转录终止区（terminator）： 是DNA分子中决定RNA聚合酶终止转录的一段回文核苷酸序列。分为两类：不依赖因子的终止子的回文序列中富含GC碱基对，在回文序列的下游方向又常有68个AT碱基对；而依赖因子终止子中回文序列的GC对含量较少。在回文序列下游方向的序列没有固定特征，其AT对含量比前一种终止子低。,大肠杆菌中蛋白表达形式,(1)完整目的蛋白 (2)融合蛋白：两个或多个基因的开放阅读框按一定顺序连接在一起表达形成的蛋白。 当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。通过以融合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag），常用的有谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase, GST）、六聚组氨酸肽（polyHis-6，6His tag）、金黄色葡萄球菌蛋白质A或G（protein A, protein G ）等。,融合蛋白的表达载体,（1）GST融合表达载体 GST是来源于血吸虫的小分子酶（26kDa），在E.coli易表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有很强的结合能力。,GST表达载体在启动子tac和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列，其一是谷胱甘肽转移酶基因，其二是凝血蛋白酶（Thrombin）切割位点的编码序列。当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。 将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，融合蛋白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。然后再用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱，可将融合蛋白释放出来。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可获得纯化的目标蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位点外，其它还有肠激酶。,（2）his(组氨酸）标签表达载体,启动子下游有一段编码6个组氨酸的序列，多聚组氨酸肽能与2价金属离子结合（镍离子），将镍离子固定在树脂上，便可对带His标签的融合蛋白进行亲和层析分离。,真核表达载体 酵母表达载体 昆虫表达载体 哺乳动物细胞表达载体,酵母表达载体 酿酒酵母和毕赤酵母 毕赤酵母载体:均为大肠杆菌-毕赤酵母穿梭载体,毕赤酵母启动子（来自乙醇氧化酶基因AOX1），受到甲醇严格控制。,哺乳动物细胞表达质粒载体 包括: 1）大肠杆菌的复制子及抗生素抗性基因：便于基因工程操作 2）哺乳动物的启动子和增强子：使外源基因表达 3）含有终止信号及加polyA信号：polyA上游1130bp处有一高度保守的AAUAAA序列，下游富含GU或U,Neomycin：G418,绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）：从水母体内发现的发光蛋白，分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。,如利用GFP 的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。,内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site, IRES）。 IRES能招募核糖体对mRNA进行独立地翻译。,3）穿梭质粒 穿梭载体（Shuttle vector）是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。 酵母、昆虫、哺乳动物细胞等使用的表达载体，一般都有在大肠杆菌中复制的元件，因此都具备穿梭载体的特征，如大肠杆菌/酵母、大肠杆菌/昆虫细胞、大肠杆菌/哺乳动物细胞穿梭载体等。,5、质粒DNA的分离纯化 实验室一般使用下列2种方法制备质粒DNA： 1)氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染 2)碱裂解法 方便、快速，满足一般需要,1）氯化铯密度梯度离心法：,原理：是一种沉降平衡离心法，经超速离心，离心介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。其中蛋白质密度小（1.3 g/cm31.4g/cm3），浮于液面；RNA密度大（2.0g/cm3），沉于管底；各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间，处于中部。过量EB处理前，细菌染色体DNA与不同分子构型的质粒DNA的密度均为1.7g/cm3左右，难以区分。经过量EB处理后，不同分子构型的DNA与EB的结合能力不一样，因而密度下降不一致，可有效分离。其中，闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入，结合量少，密度下降小，约为1.59 g/cm3；而染色体DNA、开环质粒DNA以及带切口的环状质粒DNA可以嵌入更多的EB，密度下降较多，约为1.54 g/cm3，从而能与闭环质粒DNA分开。,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,过程：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加CsCl和溴乙锭 超速离心过夜 在紫外灯下吸取cccDNA 稀释沉淀cccDNA,2）碱变性法 原理：碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异，在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。,试剂 1. LB培养基 2. 溶液 I 3. 溶液 4. 溶液III 5. TE(pH8.0) 稳定,LB培养基 配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入： 细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/L NaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15 lbf/in2(1.034105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。,溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L TrisCl (pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 在10 lbf/in2(6.895104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4。 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活,溶液 II 0.2 mol/ L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释) 1% SDS 作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。,溶液 III 5mol/L 乙酸钾 冰乙酸 水 作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS使线性DNA、蛋白沉淀,培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37培养1216小时; 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1 ，充分混匀放置3-5分钟; 加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（溶液II），加盖颠倒6-7次使之混匀；,质粒小量提取的方法（手工提取）：,加入150 l溶液III，加盖后颠倒6-7次混匀，放置5min; 用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液; 沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次， 12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥; 加入30-50l含有20g/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提); 将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。,1、 噬菌体的生物学特性,三、噬菌体载体,有尾部结构的二十面体 噬菌体由外壳包装蛋白和DNA组成。,裂解周期和溶原周期,2、噬菌体的生活周期,裂解周期,溶原周期 噬菌体感染大肠杆菌后，通过同源重组，将其DNA整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种状态称为溶原状态，这个过程称溶原化。整合主要由 -DNA上的c和int两基因的产物所激活。 原噬菌体（prophage)： 整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。,3、噬菌体的基因组,1）线状双链DNA分子，全长48.502bp。 2）两端的5末端具有12碱基的突出互补的粘性末端（cohensive end，cos），该末端称为cos位点。 3）当侵入宿主细胞后，线状DNA分子借助粘性末端连接成环状分子。,DNA 基因结构,b2区和重组基因区是噬菌体进入裂解周期的非必需区（15kb ，约占噬菌体DNA的1/3 ），可将该区缺失或用外源DNA片段取代，对噬菌体的感染和生长都不会造成影响。,4、 -DNA载体的构建,噬菌体的缺陷：, 基因组太大（49kb），只能接纳一定长度的DNA。 酶切点太多， 5个EcoRI位点和7个HindIII位点,噬菌体的改造, 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）； 去掉太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口； 野生型的 -DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个。同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加些单一的酶切位点。采用定点突变技术去除或增添酶位点。 增加标记基因； (4) 引入无义突变。,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,插入型载体:通过特定的酶切位点允许外源DNA片断插入的载体（0-11kb) 。,体外包装,体外包装,插入片段,插入片段,置换型载体:允许外源DNA片断替换非必需DNA片断的载体(9-23kb)。,加装选择标记,与质粒不同，野生型-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是-DNA克隆载体构建的重要内容,-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记imm434 颜色反应类标记lacZ ,加装选择标记 imm434,imm434基因：编码一种阻止 -噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， -重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑,加装选择标记 lacZ,lacZ基因编码-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体-DNA则产生蓝色透明斑,构建琥珀密码子的突变体,将野生型 -DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这