课件：帕金森病模型定稿.pptx

帕金森病动物模型,实验动物学：四组 组员：张鑫、赵向男、 张岩、李晓 2016.11.14,帕金森病又称震颤麻痹，是一种由于脑内黑质纹状体通路多巴胺缺乏所致的，在老年人中常见的进行性中枢神经系统退行性疾病。,此病主要病理特征为黑质多巴胺(DA)能神经元缺失及胞质内包涵体-路易小体(Lewy body)出现,主要 症状,静止性震颤,肌强直,运动迟缓,体位不平衡、步态紊乱,焦虑、睡眠障碍等非运动症状,脊髓前角 运动神经元,调节运动功能,黑质,纹状体,DA,ACh,作用过程,正常,帕金森病,多巴胺,多巴胺,乙酰胆碱,乙酰胆碱,Jame Parkinson首先在1817年对帕金森病的临床表现进行了描述。当时，对PD的发病机制几乎一无所知。直到20世纪50年代Carlson等对啮齿类动物注射利血平后，使动物产生类似PD样症状，这是最早建立的PD动物模型。,PD动物模型的发展,随着对儿茶酚胺特异性神经毒素六羟基多巴胺(6-Hydroxydopamine，6-OHDA)的认识，在1968年Vngerstedt等人成功地建立6-OHDA动物模型。之后，于1983年Brundin等报道了利用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)制作小鼠和猴的PD动物模型。,在国内，周厚广等用两点注射法将6-OHDA注入大鼠一侧的黑质及内侧前脑束，成功率高达71.1%，电镜观察可见中脑黑质神经细胞普遍存在变性坏死及不同阶段的凋亡改变，可以较快地建立稳定地成功率较高的类似于人类中晚期帕金森病行为和病理的大鼠模型。随着研究的深入，相继出现了NO、Fe3+及机械损伤的PD动物模型，根据研究目的的不同，选择不同的PD动物模型。,帕金森病动物模型的制备,为模拟人类PD，理想的动物模型应具备以下一些特点：,（1）多巴胺能神经元在出生时数量及形态正常，青年时期开始逐渐选择性地减少，减少量超过50，且容易通过神经化学和神经生理学的方法检测到； （2）模型应能容易检测其运动功能的损伤，包括运动迟缓、肌僵直和静止性震颤等PD的主要症状；,（3）模型应能显示出路易小体的形成； （4）如果模型是遗传性的，应基于单一突变而使突变模型有着强大的传播能力； （5）模型应有相对较短的疾病周期（如数月），以使药物筛选得以经济、快速地进行。,通过在大鼠的黑质或内侧前脑束注射6羟多巴胺（6-OHDA） 通过对模型动物(如:猴、小鼠、猪等)进行1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）的管饲法和立体定位注射等方法,国际通用国内应用较多是两种方法：,模型制备方法,前者是较精典的模型制备的方法，也是在国内较早开展的，但是由于神经元的毁损出现的较早，这与临床PD病人的中脑黑质多巴胺能神经元的渐进性死亡不同； 近距离的毁损很难把握毁损的程度，这使得采用这种方法获取部分损毁的模型的成功率很低；,存在的问题,较之前者采用MPTP管饲法和立体定位注射方法，在国内最近几年才运用到帕金森动物模型的制备，国外已经利用MPTP在猴和小鼠身上建立了较为理想的PD模型，制备通常采用皮下、静脉、腹腔注射和肌肉给药，具有方法可靠且重复性较好。但是其危险性较高，对于试验人员和试验条件有着严格的要求,模型制备,应用6-OHDA制备偏侧PD鼠模型,应用MPTP制备PD动物模型,其它建模方法,应用6-OHDA制备偏侧PD鼠模型,1）雄性Sprague-Dawley大鼠，体重230250g 2）戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后，固定于立体定向仪 3）参照大鼠脑立体定位图谱,取两个靶点，将12g 6- OHDA立体定向注射于右侧黑质a、b两个靶点(每点 注射量6g，浓度2gl，溶解于含0.1%抗坏血酸 的生理盐水中)。注射速度0.3lmin注毕留针 15min。,应用MPTP制备PD动物模型,灵长类PD模型,恒河猴戊巴比妥腹腔麻醉下，切开颈部皮肤，暴露一侧颈总动脉。将新鲜配制的MPTP按1.01.5mgkg体重溶于2mL生理盐水中，逆血流方向缓慢注入血管中。若动物在第1次手术后PD症状不明显，分别在每隔5d后又给予第24次注射，直至PD症状出现。,小鼠PD模型,小鼠对MPTP的敏感性存在种系和年龄的差异。一般选1012周龄，体重2530g成年C57BL褐鼠，按体重3040 mgkg腹腔注射MPTP，连续7d。于第67次注射后出现暂时性(23h)躯干震额、竖毛、尾巴过伸、动作减少及爬杆试验障碍,利血平主要可以通过抑制去甲肾上腺素能神经元末梢的再摄取功能，使囊泡内贮存的多巴胺(DA)及其他的儿茶酚胺类递质耗竭。将雄性Wistar大鼠(体重280300g)腹腔内注射一定剂量的利血平后可使其出现骨伤肌慢硬、震颤、身体屈曲、运动过少以及其他的一些运动症状。神经化学分析发现大鼠纹状体内DA和其他单胺类递质的含量明显减少,利血平模型,其它建模方法,它存在明显的不足：一是药物注射造成的运动障碍在不同时间和不同个体之间变异性较大；二是利血乎同时引起了多种递质释放并且无法造成类似PD的病理改变。因此该模型的应用只局限于探索药物影响肌僵状态的实验中，对其他的运动症状的研究现已很少应用,1991年Ben-Shachar在雄性SD大鼠(250300g)单侧黑质内注射Fe3+三周后可使其出现明显的运动行为改变，表现为在新环境中自主运动减少，短暂的僵直症状及自发的同测旋转行为。,Fe3+模型,研究发现机械损伤内侧前肋束(MF可以造成黑质内的DA能神经元进行性死亡。已经建立的造模方法有MFB独突切断术和中脑半切术，尤以前者应用较多。,机械损伤模型,用该方法造模有如下优点： 成功率高，较为经济。 黑质DA能神经元呈现渐进性死亡，可以模拟PD病理变化的全过程，对于研究神经元的再生和PD的预防有一定的意义。 缺点是切断术后短时间内，损伤的程度不稳定。,6-OHDA大鼠模型： 在注射6-OHDA后连续6周进行行为学检测，用阿朴吗啡腹腔注射，15分钟后出现旋转,旋转时以健侧后肢为支点,身体向健侧弯曲,首尾相接,原地转动。有的甚至出现翻转,有的呈小环行旋转，速度7r/min视为成功模型。通过旋转记录仪计算一定时间内旋转的总次数，可以粗略估计大鼠脑内DA能神经元的死亡程度。,动物模型的评价,行为学测试,MPTP致灵长类PD模型： 腹腔注射或静脉注射MPTP第2天，动物即出现自发性运动减少，呈进行性加重，以至于运动不能，弓背姿势，四肢紧张性弯曲，肌强直伴震颤，吞咽困难，不能进食及发音减弱。,MPTP小鼠模型： 爬杆实验：将一直径为25cm的软木小球固定于一根长50cm、粗1cm的木杆顶部,木杆上缠上纱布以防打滑，然后将被测小鼠放到小球上，并记录以下时间：小鼠从小球上下来所需的时间，小鼠爬完秆子的上半部和下半部所需的时间。,游泳实验：将受试小鼠放入一个203020cm的水箱中，水温为2225。若在受试时间内能连续不断的游泳者记3分，大部分时间游泳仅偶尔漂浮者记2.5分，漂浮时间占整个受试时间50%以上者记2.0分，偶尔游泳者记0.5分，偶尔用后肢游动并漂浮在一起者记1.0分。以正常小鼠作为对照，最后计算得分情况，并作统计学分析。,将PD动物麻醉后，用0.9%盐水和4%多聚甲醛灌注固定，连续冰冻切片，行酪氨酸羟化酶免疫组织化学染色。毁损一侧黑质和腹侧背盖区的TH阳性神经元明显消失，而同一脑片健侧可见大量TH阳性神经元。,形态学评价,利用高效液相2电化学法测定PD模型黑质及纹状体中多巴胺及其代谢产物高香草酸(HVA)含量，结果发现各种动物模型毁损侧黑质、纹状体内DA、HVA含量均显著降低。,神经生化改变,治疗,金刚烷胺,左旋多巴,抗胆碱能 药物,多巴胺受体 激动剂,抗胆碱能药物,药物：东莨菪碱、盐酸苯海索,作用：1、能维持纹状体的递质平衡 2、对震颤和肌强直有效,金刚烷胺,1、促进神经末梢释放多巴胺，并阻止 其再摄取； 2、能改善震颤、肌强直和运动迟缓等 症状。,左旋多巴制剂,左旋多巴合并多巴脱羧酶抑制剂是目前最有效的药物。 对各期病人都有效，但一般主张病人出现姿势平衡障碍或工作受到影响时使用，它对运动迟缓和肌强直疗效好，对震颤亦有效。,多巴胺受体激动剂,1、早期：可延缓多巴胺代替药物的使 用； 2、中晚期：改善症状，并减少替代药 物的用量。,随着对PD的发病机制研究的不断深入，目前，已有学者应用PD患者血清IgG、脂多糖(LPS)、铁离子(Fe3+)、32氮基酪氨酸注射于单侧黑质来建立偏侧PD大鼠模型。VanderPutten等已成功地制备了-synuclein转基因小鼠和转基因果蝇，高表达人类-synuclein的转基因小鼠具有PD的部分特征。总之，目前建立的PD动物模型都是使动物在短时间内出现帕金森病的症状或病理变化，很难模仿帕金森病这一神经系统的慢性疾病的自然进程。因此，获得一种更为理想的帕金森病动物模型，将更有利于对帕金森病的发病机制及实验治疗进行深入研究。,机遇与挑战,除上述模型，McNaught等还建立了EpoxomicinPD动物模型。Epoxomicin为一种蛋白酶体抑制剂，此模型为研究人类PD相关的运动障碍和病理病因学提供了一个很有价值的平台。目前，在常染色体显性PD家族患者脑内发现的高表达突变的亮氨酸丰富区重复激酶2(leucine2richrepeatkinase2，LRRK2)在PD发病过程中可能具重要作用，为建立新的基因模型提供了理论基础。此外，采用细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，BAC)技术介导-synuclein转基因鼠模型也将成为今后研究PD致病机制的有力工具。 尽管目前尚无完全理想的PD模型,但随着PD分子发病机制研究的逐步深入，相信PD动物模型的建立将更日臻完善。,参考文献,1、王彦永，顾平.建立帕金森病动物模型的研究进展， 中风与神经疾病杂志，2004， 21（4）：379-382 2、陈欢意，牛平.帕金森病动物模型的研究进展，解 剖科学进展, 2005, 11(4):362-366 3、王 涛,左萍萍.帕金森病实验动物模型研究进展， 中国神经免疫学和神经病学，2008，15（6）： 455-458 4