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金川厂化验培训系列课程 微生物基础知识,田巧生 2010年5月10日,-,目录,一 微生物简介 二 菌落 三 霉菌和酵母菌 四 菌落总数的测定 大肠菌群的测定 霉菌和酵母菌的测定 乳酸菌的测定 八 嗜冷菌的测定,-,目录,九 芽孢的测定 十 耐热芽孢的测定 染色技术 显微技术 消毒、灭菌 培养基 接种技术,-,一、微生物简介,1.概念 微生物是一群形体微小、结构简单、肉眼看不见，需借助显微镜才能看到的微小生物的总称。,-,一、微生物简介,2.分类 1）细胞形态的微生物。有真核微生物（如酵母、霉菌） 和原核微生物（如细菌） 2）非细胞形态的微生物（如病毒） 3.特点 个体微小、结构简单；繁殖速度快；代谢旺盛；种类 多；易变异；数量多。 4.基本形态: 球状、杆状、螺旋状。,-,一、微生物简介,1). 球菌(coccus） 菌体呈球形或近似球形,以典型的二分裂殖方式繁殖,分裂后产生的新细胞常保持一定的空间排列方式.根据细胞分裂的方向及分裂后的各子细胞的空间排列状态不同,可将球菌分为以下几种: 单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。,-,一、微生物简介,(1)单球菌 分裂后的细胞分散而 单独存在的球菌。 如：尿素微球菌。,-,一、微生物简介,(2).双球菌 分裂后两个球菌成对 排列的为双球菌。 如：肺炎双球菌,-,一、微生物简介,(3)链球菌 分裂是沿一个平面 进行，分裂后形成 一个长链。 如：乳链球菌、粪链球菌,-,一、微生物简介,(4)四联球菌 分裂是沿两个相垂直的 平面进行，分裂后每四个细胞 在一起呈田字形。 如：四联微球菌,-,一、微生物简介,(5)八叠球菌 按三个互相垂直的平面进 行分裂后，每八个球菌在 一起成立方体形. 如：藤黄八叠球菌,-,一、微生物简介,(6)葡萄球菌 分裂面不规则，多个球菌聚在一起，像一串串葡萄。 如：金黄色葡萄球菌,-,一、微生物简介,2).杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。一般情况下,同一种杆菌的宽度比较稳定,但它的长度经常随培养时间、培养条件的不同而有较大的变化。 棒杆、梭状、链杆、芽孢杆菌、球杆菌（菌体粗短呈卵圆形）。,-,一、微生物简介,3).螺旋菌：螺旋状的细菌称为螺旋菌。 根据其弯曲情况分为： 弧菌：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形 例：霍乱弧菌、逗号弧菌 螺旋菌：螺旋满26环，螺旋状 例：干酪螺菌 螺旋体：旋转周数在6环以上，菌体柔软。 例：梅毒密螺旋体,-,一、微生物简介,弧菌,螺旋菌,螺旋体,-,一、微生物简介,4).细菌的特殊形态： 柄细菌、肾形菌、臂微菌、网格硫细菌、贝日阿托氏菌(丝状)、具有子实体的粘细菌、三角形、方形等特殊形态的细菌。,-,一、微生物简介,5.结构 基本结构包括：细胞壁、细胞膜、细胞质、核质等。 特殊结构包括：荚膜、鞭毛、纤毛、芽孢。 芽孢概念：某些菌生长到一定阶段，细胞内形成一个圆 形、椭圆形或卵圆形的内生孢子，是对不良环境有较强抵抗力的休眠体,-,一、微生物简介,产生芽孢的几个属： 在杆菌中只有两属是产生芽孢的： 1、芽孢杆菌属。 2、梭状芽孢杆菌属。 在球菌中只发现一种尿素 八叠球菌是产芽孢的。,-,一、微生物简介,芽孢的几种形态,A 近中央,B 末端,C 中央,-,一、微生物简介,芽孢的特性: 1)具有很强的抗热、抗干燥、抗辐射、抗化学药物能力。 2)含水量低、壁厚而致密，通透性差,不易着色。 3)新陈代谢几乎停止，处于休眠状态。 4)一个芽孢萌发产生一个个体。 芽孢的抗热机制：如含水量低、壁厚而致密，芽孢中的酶分子量小，比较耐热。,-,一、微生物简介,-,一、微生物简介,芽孢形成细菌在营养体状态时如同其它细菌一样，在100温度下，煮沸数分钟就会被杀死 芽孢遇到适宜的环境条件时，芽胞又萌发形成营养细胞 芽孢不进行新陈代谢，在干燥的空气中能生存数年，而且对化学杀菌剂、抗菌素、干燥和紫外线比营养体有更强的抵抗力。它们耐热，在121温度下持续20min 才能100% 地将芽孢杀死。,-,二.菌落,1.菌落：在固体培养基上,由单个细胞繁殖形成的肉眼可见的子细胞群体 不同的微生物种类，其菌落特征不同。同一种菌在不同培养条件下菌落特征也不尽相同。 菌落的特征： 包括大小、形状、颜色、边缘、质地、透明度、光泽、表面、湿润度等。,-,二.菌落,细菌菌落一般可分为三型： 1)、光滑型菌落（S型） 表面光滑、湿润、边缘整齐。 2)、黏液型菌落（M型） 黏稠、有光泽、似水珠样（肺炎杆菌、流感杆菌） 3)、粗糙型菌落（R型菌落） 表面粗糙、干燥、有皱纹,-,三.霉菌和酵母菌,霉菌和酵母同属于真菌。 真菌的概念：指具有细胞壁、以寄生或腐生方式生存，不进行光合作用的真核细胞型微生物。 霉菌：为丝状真菌的统称。凡是在营养基质上能形成绒毛状、网状或絮状菌丝体的真菌（除少数外），统称为霉菌。 1.霉菌的分布： 在自然界分布相当广泛，无所不在，而且种类和数量惊人。,-,三.霉菌和酵母菌,一般情况下，霉菌在潮湿的环境下易于生长，特别是偏酸性的基质当中。 2.危害. 1) 引起霉变：可造成食品、生活用品以及一些工具、仪器和工业原料等的霉变。 2) 引起植物病害 3) 产生毒素，引起食物中毒：霉菌能产生多种毒素，目前已知有100种以上。例如：黄曲霉毒素，毒性极强，可引起食物中毒及癌症。,-,三.霉菌和酵母菌,4)引起动物疾病。 一般的巴氏杀菌72-75，保持10-15秒，霉菌就会死亡，所以这些有害有机体的存在是二次污染的一个指标。 3.菌体可沿培养基表面蔓延生长，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈现红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。,-,三.霉菌和酵母菌,4. 酵母菌（yeast）是一通俗名称，没有确切定义。 一般认为酵母菌具有以下特点： 1)个体一般以单细胞状态存在； 2)多数出芽繁殖，也有的裂殖； 3)能发酵糖类产酸； 4)喜在含糖量较高、酸度较大的环境中生长.,-,三.霉菌和酵母菌,5.酵母菌的危害： 腐生性酵母菌能使食物、纺织品和其他原料腐败变质； 少数耐高渗的酵母菌和鲁氏酵母、蜂蜜酵母可使蜂蜜和果酱等败坏； 有的酵母菌是发酵工业的污染菌，影响发酵的产量和质量； 某些酵母菌会引起人和植物的病害.酵母菌是一群单细胞的真核微生物,其形态因种而异.通常为圆形、卵圆形或椭圆形。也有特殊形态，如柠檬形、三角形、藕节状、酵母的大小、形态与菌龄、环境有关。一般成熟的细胞大于幼龄的细胞，液体培养的细胞大于固体培养的细胞.,-,三.霉菌和酵母菌,1）在固体培养基上的菌落特征： 菌落大而厚，圆形，光滑湿润，粘性，颜色单调。常见白色、土黄色、红色。,-,三.霉菌和酵母菌,2）液体培养 在液体培养基上，不同的酵母菌生长的情况不同。 好气性生长的酵母可在培养基表面上形成菌膜，其厚度因种而异。 有的酵母菌在生长过程中始终沉淀在培养基底部。 有的酵母菌在培养基中均匀生长，使培养基呈浑浊状态。,-,四.菌落总数的测定,1.菌落总数的概念： 按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数。 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。及时反映食品加工过程中是否符合卫生要求.通常认为，食品中细菌数,-,四.菌落总数的测定,量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少 在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。 2.菌落总数的测定： (GB/T 4789.2-2003) 一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后，记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。,-,四.菌落总数的测定,1)基本操作：样品的稀释倾注平皿培养48小时计数报告。 2)样品的处理和稀释： 样品必须混匀 样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。 吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm。 每步必须无菌操作,-,四.菌落总数的测定,3.培养 培养基温度：46水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。 培养基的量：一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，且不易摇匀;太薄又易于失水干裂。 倾注时，培养基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。,-,四.菌落总数的测定,检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过15min，以防止细菌繁殖或产生片状菌落。 培养箱应保持一定的湿度（平常培养箱中放置一小杯蒸馏水）琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15。,-,四.菌落总数的测定,. 为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培养基混合的平板，不经培养，而于4环境中放置，以便计数时作对照观察。 . 皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。,-,四.菌落总数的测定,4.计数和报告 到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。 不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比，即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准,-,四.菌落总数的测定,c N= （ n1 +0.1 n2 ) d 若检测的产品中，所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。 每个平板上的菌落数均需记录于原始记录中，如平行样、稀释度、各项空白实验等。环境监测、试剂空白对照试验培养后未长菌时，结果均以“无菌落生长”进行报告。当有菌生长时须保留样品及时汇报，分析原因再作处理，如果空白试验不符合要求，微生物结果不能出具。,-,五 大肠菌群的测定,1.大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。 1) 定义：需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。,-,五 大肠菌群的测定,2) 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 MPN 为最大可能数。表示样品中活菌的密度，是用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。,-,五 大肠菌群的测定,3）各步实验目的 初发酵（其目的在于检查样品中有无发酵产生气体的细菌） 分离培养（平板分离的目的在于检查乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内，有无需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌存在） 证实试验 （复发酵实验，检验的目的在于证明从乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体） 4）结果报告注意事项,-,五 大肠菌群的测定,各项空白对照实验的结果均需记录于原始记录中。 如空白对照管培养后无产酸、产气时，结果报告阴性即可。 大肠菌群三步法的结果均需记录于原始记录中，记录方式统一为： 1）初发酵为阳性时，用“+”表示； 2）分离培养为一、二或三类菌落，分别用 “、”在右下角表示； 3）革兰氏染色为阴性或阳性时，分别用“-、+”，球菌、杆菌分别用“c、b” 在右上角表示； 4）复发酵为阳性时，在初发酵的“+”上加一圆圈表示。例如： + Ib-表示初发酵为阳性，分离培养为一类菌，革兰氏染色为阴性杆菌，复发酵为阳性。,-,六 霉菌和酵母菌的测定,1.霉菌和酵母菌的测定(GB/T4789.15-2003) 基本操作一般包括： 样品的稀释倾注平皿培养5天计数报告。 2.样品的稀释：无菌水,-,六 霉菌和酵母菌的测定,为了减少稀释倍数的误差，在连续递增稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。 在稀释过程中，为了使霉菌的孢子充分散开，需用灭菌吸管反复吹吸50次。 3.培养基的选择：孟加拉红培养基.（原因） 1）孟加拉红使培养基变为红色，红色背景下便于计数。 2）孟加拉红和氯霉素能抑制原核生物（如细菌）生长，利于霉菌和酵母菌生长。 3）孟加拉红能抑制霉菌的蔓延生长，避免将酵母菌遮盖而无法计数。,-,六 霉菌和酵母菌的测定,4.倾注培养： 每个样品应选择3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45，立即倾注并旋转混匀。大多数霉菌和酵母在2530的情况下生长良好，因此培养温度25-28。培养3d后开始观察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。,-,六 霉菌和酵母菌的测定,5.菌落计数及报告： 选取菌落数10-150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。固体检样以g为单位报告，液体检样以mL 单位报告。关于稀释倍数的选择可参考细菌菌落总数测定。,-,七 乳酸菌的测定,1.定义： 指一群分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧， 多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性无芽孢杆菌和球菌。 种类：乳酸链球菌，乳酸杆菌，明串珠菌 培养基：改良MC培养基或改良TJA培养基 培养条件: 361 723h,-,七 乳酸菌的测定,2.菌落计数： 1）观察菌落形态,选30300间的平板计数 2）选5个菌落作证实试验 3)计算：35取5个有4个相同 354/5=28 再乘以稀释倍数,-,八 嗜冷菌的测定,1.嗜冷菌： 指在6.5条件下，需氧培养10d，在MPC琼脂平板上形成可 计数菌落的细菌、酵母和霉菌。 2.培养基：MPC琼脂培养基（PCA琼脂培养基+0.1%脱脂粉） 3.结果计算 保留含有10个300个菌落的培养皿。 用下列公式（1）计算每毫升样品中的嗜冷菌数： N= c （ n1 +0.1 n2 +0.01 n3 ) d,-,八 嗜冷菌的测定,N 样品中嗜冷菌数，cfu/mL； c 所有保留培养皿中计数菌落的总和； n1 保留的含有10个300个菌落的培养皿中第一个稀释度的培养皿数； n2 保留的含有10个300个菌落的培养皿中第二个稀释度的培养皿数； n3 保留的含有10个300个菌落的培养皿中第三个稀释度的培养皿数； d 第一个稀释度的稀释因数。 结果保留两位有效数字。,-,八 嗜冷菌的测定,如果菌落数均小于10，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数，报告每毫升牛奶菌落的估计数。 如果菌落数均超过300，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数，报告每毫升牛奶菌落的估计数。,-,九 芽孢的测定,指在有氧条件下，经80加热处理10min，能存活并且于36下培养48h在锰盐琼脂平板上形成可计数的菌落总数。 加热处理 1 .用无菌吸管吸取液体检样、固体或半固体检样的初级稀释液5mL10mL于无菌试管中。 2 . 立即将上述试管放入801的水浴中，使试管内液面至少低于水面4cm。 3 . 加热处理10min1min。在对照管中放一支温度计测定温度。试管内样液的升温时间不应超过5min。,-,九 芽孢的测定,4 . 将加热处理后的试管取出立即放到20以下的流水中冷却待琼脂凝固后，翻转平板，置(30-35)培养箱下培养72h。 菌落计数方法参见菌落总数的计数方法。 菌落数的报告参见菌落总数的报告方式。,-,十 耐热芽孢的测定,1.嗜热需氧芽孢 指在有氧条件下，经100加热处理30min，能存活并且于55下培养48h在锰盐平板上形成可计数菌落的微生物。 2.检测操作步骤与芽孢菌相同，只是加热温100.,-,十 耐热芽孢的测定,待琼脂凝固后，翻转平板，将1组平皿置于(30-35)培养箱，另一组放入(50-55)培养箱内，均培养72h。 菌落计数方法参见菌落总数的计数方法。 菌落数的报告参见菌落总数的报告方式。 在(30-35)条件下培养的菌落数为耐热适中温菌的芽孢数，而在(50-55)条件下培养的菌落数为耐热嗜热型的芽孢数。计数两个温度下的总和为每毫升测试样品中的总耐热芽孢总数。,-,十一 染色技术,为什么进行染色？ 为了在使用显微镜时，使细胞与其背景的色差增大，轮廓显示更为清晰，常使用染色技术使微生物着色而达到目的。但是任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。 染色方法： 单染色 复染色,-,十一 染色技术,标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个： ）杀死微生物，固定细胞结构。 ）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉 。 ）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。 革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由丹麦医生于1884年创立。,-,十一 染色技术,基本步骤： 滴加适量无菌水-涂片-干燥-固定-结晶紫初染1min水洗-碘液媒染1min-水洗-95%乙醇脱色0.5min水洗-番红复染1min水洗（晾干或吸干）-镜检-结果报告 结果: 革兰氏阳性菌紫色； 革兰氏阴性菌红色。,-,十一 染色技术,革兰氏染色原理： G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。 G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。,-,十二 显微技术,一.用香柏油目的：提高介质折射率，当空气为介质时折射率为，而香柏油的折射率为1.51，载玻片的玻璃折射率1.52，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。 显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。,-,十二 显微技术,二、普通显微镜的保养 1、 观察完后，移去观察的载玻片标本。 2、用过油镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭23次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。 3、转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。,-,十二 显微技术,将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。 镜头的保护最为重要。镜头要保持清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸擦拭。擦镜纸要放在纸盒中，以防沾染灰尘。切勿用手绢或纱布等擦镜头。,-,十三 消毒、灭菌,消毒：是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法。 常用消毒方法 1）紫外线消毒:紫外灯距物体表面1m，照射30min 2）漂白粉（次氯酸钙）：5-10g/L的水溶液5min内 可杀死大多数细菌 3）乙醇（70-75）：是常用的皮肤和物体表面消毒剂。酒精能使菌体蛋白质脱水变性。高于75%浓度的酒精因脱水作用太快，使菌体表面迅速凝固而阻止了乙醇分子继续渗入故杀菌效力反而降低）,-,十三 消毒、灭菌,灭菌：是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物（包括病源和非病源微生物，细菌的繁殖体和芽孢），使之呈无菌状态。 1）灼烧灭菌法：适合于接种针、环、试管口。 2）干热灭菌法：160C， 2h，适合于玻璃器皿。 3）湿热灭菌法: 常压灭菌法：将待灭菌的物品加热至100C，1530分钟，杀死其中的营养体。然后冷却，放入37C恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三次左右，就可达到灭菌的目的。 加压蒸汽灭菌法：121C，在1520分钟。（最常用，最有效的灭菌方法）,-,十三 消毒、灭菌,商业无菌：指食品经灭菌处理后，按照规定的微生物检验方法，在所检食品中无微生物产生的毒素，无活的微生物检出，或仅能检出极少量的非病源微生物，但它们在食品贮存过程中不可能生长繁殖的灭菌要求。 防腐：防止或抑制微生物生长繁殖的方法。,-,十四 培养基,一 定义 培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需要的各种营养物质，由人工配制而成的营养基质，它专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保存用。 二 组成 为了满足微生物生长和代谢的需要，培养基必须包含碳源、氮源、水、无机盐和生长因子五大类营养物质。 营养物质的来源：,-,十四 培养基,三 配制 1）培养基摇匀后准确称量； 2）使用蒸馏水或去离子水配制培养基； 3）宜用中性玻璃容器，不宜用铜或铁质容器； 4）加热溶解时应适当搅拌，培养基不能过度加热； 5）培养基高压灭菌后不能长时间处于高温状态，应适当水浴及时使用或迅速冷却保存。,-,十四 培养基,四、存放干粉培养基应于阴凉、干燥、避光处保存，不能在冰箱保存，防止受潮结块；干粉培养基的保质期未