饲料中维生素A、维生素D3、维生素E的同步快速测定高效液相色谱法（定稿）

ICS65.120B 46DB37山东省地方标准DB 37/T XXXXXXXXX饲料中维生素A、维生素D3、维生素E的同步快速测定高效液相色谱法XXXX - XX - XX发布 - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/ XXXXXXXXX目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 原理14 试剂或材料15 仪器设备26 样品27 试验步骤27.1 提取27.2 浓缩27.3 液相色谱参考条件37.4 标准系列溶液37.5 测定38 试验数据处理38.1 维生素A乙酸酯含量38.2 维生素D3含量48.3 维生素E乙酸酯含量59 精密度5附录A （规范性附录） 维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E乙酸酯标准溶液浓度校正方法6附录B （资料性附录） 维生素A乙酸酯、维生素D3和维生素E乙酸酯标准溶液的高效液相色谱图7前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省饲料质量检验所、青岛市华测检测技术有限公司。本标准主要起草人：强莉、吕明春、刘雪芹、李斌、宫玲玲、李俊玲。7饲料中维生素A、维生素D3、维生素E的同步快速测定高效液相色谱法1 范围本标准规定了饲料中维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E乙酸酯测定的高效液相色谱方法。本标准适用于复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E乙酸酯的测定。其他饲料可参照执行。本方法定量限：维生素A乙酸酯为10 000 IU/kg；维生素D3为40 000 IU/kg；维生素E乙酸酯为100 mg/kg。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1饲料采样GB/T 20195动物饲料试样的制备3 原理试样中的维生素A乙酸酯、维生素D3和维生素E乙酸酯用二甲基亚砜(DMSO)超声溶解，经正己烷萃取、浓缩、复溶后，供高效液相色谱仪测定，外标法定量。4 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.1 水：GB/T 6682，一级。4.2 正己烷。 4.3 二甲基亚砜（DMSO）：色谱纯。4.4 甲醇：色谱纯。4.5 维生素A乙酸酯标准储备溶液（1 mg/mL）：称取维生素A乙酸酯标准品（CAS：127-47-9，纯度不低于99.0 %）50 mg(准确至0.01 mg)于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.4)溶解定容。置-18 冰箱保存，有效期为3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录A）。4.6 维生素D3标准储备溶液（1 mg/mL）：称取维生素D3标准品（CAS：67-97-0，纯度不低于99.0 %）50 mg(准确至0.01 mg)于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.4)溶解定容。置-18 冰箱避光保存。有效期为3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录A）。4.7 维生素E标准工作溶液（1 mg/mL）：称取DL-生育酚乙酸酯标准品（CAS：7695-91-2，纯度不低于99.0 %）50 mg(准确至0.01 mg)于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.4)溶解定容。置-18 冰箱避光保存。有效期为3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录A）。4.8 维生素A标准工作液：准确吸取1.00 mL的维生素A标准储备液（4.5）于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。维生素A标准工作液浓度为100 g/mL。于-18 保存，有效期为半个月。4.9 维生素D3标准工作液：准确吸取0.50 mL维生素D3标准储备液（4.6）于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。维生素D3标准工作液浓度为50 g/mL。于-18 保存，有效期为半个月。4.10 析相分离纸：1 PS。4.11 微孔滤膜：0.22 m，有机相。5 仪器设备5.1 高效液相色谱仪：配有紫外或二极管阵列检测器。5.2 电子天平：感量为0.1 mg和0.01 mg。5.3 紫外分光光度计。5.4 超声波振荡器。5.5 振荡器：频率不低于250次/min。5.6 旋转蒸发器。5.7 氮吹仪。5.8 平底烧瓶（具塞）：棕色500 mL。6 样品按GB/T 20195制备试样，取不少于250 g样品，全部过1.0 mm孔径分析筛，筛上物不大于3 %，混合均匀后，装入密闭容器中，于28 避光保存。7 试验步骤7.1 提取平行做两份试验。称取试样13 g(准确至0.1 mg)，置于500 mL平底烧瓶中，加30 mL的DMSO（4.3），在超声波水浴中超声提取30 min（水温不宜超过35度；中间旋摇23次以防样品附着瓶底）；取出放置冷却。注： 在加入DMSO的过程中，小心试样结块。先倒入少许DMSO，振摇烧瓶，将试样摇匀，再将剩余DMSO沿烧瓶壁冲洗，使附着在内壁的试样全部冲洗到烧瓶的底部。待冷却至室温后，准确加入100 mL正己烷（4.2），加盖、剧烈振摇（频率250次/min）15 min，静置分层后再次准确加入100 mL正己烷（4.2），重复提取一次，静置；待正己烷层变澄清透明，且中间乳化层消失以后，将全部正己烷层萃取液经析相分离纸过滤，待测。7.2 浓缩准确移取一定体积的滤液（依据样品标示量、称样量和提取液用量确定分取量）置于旋转蒸发器烧瓶中，在不超过40 条件下缓慢真空蒸发至近干或直接用氮气吹干。残渣用甲醇（4.4）溶解，并稀释至10 mL，使获得的溶液中每毫升含维生素A为20 IU50 IU、维生素D3为300 IU400 IU、维生素E为200 g300 g，过0.22 m微孔滤膜，待测。7.3 液相色谱参考条件色谱柱：C18，长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 m，或性能相当者。柱温：30 ；进样量：10 L；流动相：甲醇+水=97+3；流速：1.0 mL/min；检测波长：维生素A乙酸酯 325 nm；维生素D3 264 nm；维生素E乙酸酯 285 nm。7.4 标准系列溶液7.4.1 维生素A标准系列溶液：准确移取适量标准工作液(4.8)于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容配成标准系列溶液，浓度分别为：0.50 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL、5.0 g/mL、8.0 g/mL、10.0g/mL、20.0 g/mL。现用现配。7.4.2 维生素D3标准系列溶液：准确移取适量标准工作液(4.9)于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容配成标准系列溶液，浓度分别为：0.20 g/mL、0.50 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL、5.0 g/mL、8.0 g/mL、10.0 g/mL。现用现配。7.4.3 维生素E标准系列溶液：准确移取适量标准工作溶液(4.7)于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容配成标准系列溶液，浓度分别为：20.0 g/mL、40.0 g/mL、80.0 g/mL、100.0 g/mL、200.0 g/mL、300.0 g/mL、500.0 g/mL。现用现配。7.5 测定按照7.3给出的色谱参考条件，依次上机测定标准系列溶液和试样溶液。试样溶液与标准溶液中维生素A、维生素D3和维生素E的保留时间相对偏差在2.5 %之内。在仪器线性之内范围，以维生素A、维生素D3和维生素E的浓度为横坐标，以其响应值（峰面积）为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线相关系数不低于0.99。单点校准时，试样溶液与标准溶液中待测物的响应值相差不超过30 %。如超出线性范围，应用甲醇稀释（n倍）后，重新进样分析。维生素A、维生素D3和维生素E标准溶液图谱参见附录B.1B.3。8 试验数据处理8.1 维生素A乙酸酯含量8.1.1 试样中维生素A乙酸酯的含量1质量分数国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）表示，单点校准按式（1）计算：1=P1V1P2mf1n11000(1)式中：m 试样质量，单位为克（g）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；n1 稀释倍率；1维生素A乙酸酯标准工作液浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；P1 试样溶液峰面积值；P2 维生素A乙酸酯标准工作液峰面积值；f1 转换系数，1国际单位（IU）相当于0.344 g维生素A乙酸酯。8.1.2 试样中维生素A乙酸酯的含量1质量分数国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）表示，多点校准按式（2）计算：1=c1Vmf1n11000(2)式中：m 试样质量，单位为克（g）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；n1 稀释倍率；c1 由标准曲线查得试样中待测物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；f1 转换系数，1国际单位（IU）相当于0.344 g维生素A乙酸酯。平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。8.2 维生素D3含量8.2.1 试样中维生素D3含量2质量分数国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）表示，单点校准按式（3）计算：2=P3V2P4mf2n21000(3)式中：m 试样质量，单位为克（g）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；n2 稀释倍率；2维生素D3标准工作液浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；P3 试样溶液峰面积值；P4 维生素D3标准工作液峰面积值；f2 转换系数，1国际单位（IU）维生素D3相当于0.025 g胆钙化醇。8.2.2 试样中维生素D3含量2质量分数国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）表示，多点校准按式（4）计算：2=c2Vmf2n21000(4)式中：m 试样质量，单位为克（g）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；n2 稀释倍率；c2 由标准曲线查得试样中待测物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；f2 转换系数，1国际单位（IU）维生素D3相当于0.025 g胆钙化醇。平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。8.3 维生素E乙酸酯含量8.3.1 试样中维生素E乙酸酯含量3质量分数国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）表示，单点校准按式（5）计算：3=P5V3P6mf3n3(5)式中：m 试样质量，单位为克（g）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；n3 稀释倍率；3维生素E乙酸酯标准工作液浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；P5 试样溶液峰面积值；P6 维生素E乙酸酯标准工作液峰面积值；f3 转换系数，转换系数，1国际单位（IU）维生素E相当于1.0 mg dl-生育酚乙酸酯。8.3.2 试样中维生素E乙酸酯含量3质量分数国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）表示，多点校准按式（6）计算：3=c3Vmf3n3(6)式中：m 试样质量，单位为克（g）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；n3 稀释倍率；c3 由标准曲线查得试样中待测物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；f3 转换系数，转换系数，1国际单位（IU）维生素E相当于1.0 mg dl-生育酚乙酸酯。平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。9 精密度在重复性条件下两次独立测试结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的10 %。AA附录A （规范性附录）维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E乙酸酯标准溶液浓度校正方法维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E乙酸酯标准溶液配制后，在使用前需要对其浓度进行校正,具体操作如下：a) 取维生素A乙酸酯标准储备液（1 000 g/mL）100 ul于100 mL的棕色容量瓶中，用异丙醇定容至刻度，混匀，取1 cm石英比色杯，以异丙醇为空白参比，按照表A.1的测定波长测定其吸光度；b) 取维生素D3标准储备液（1 000 g/mL）100 ul于100 mL的棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，混匀，取1 cm石英比色杯，以无水乙醇为空白参比，按照表A.1的测定波长测定其吸光度；c) 取维生素E乙酸酯标准储备液（1 000 g/mL）100 ul于10 mL的棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，混匀，取1 cm石英比色杯，以无水乙醇为空白参比，按照表A.1的测定波长测定其吸光度。试液中维生素A乙酸酯、维生素D3或维生素E乙酸酯浓度按照式(A.1)计算：X=A104E1cm1%(附录A.1)式中：X 维生素标准稀释液浓度，单位为g/mL；A 维生素稀释液的平均紫外吸收值；104 换算系数；E1cm1%维生素1 %比色光系数（各维生素相应比色吸光系数见表A.1）。表A.1 测定波长及百分