固定化酶及其在化工等领域中的应用.doc

固定化酶及其在化工等领域中的应用08生物工程2班陈永良 *引言 酶是一类具有生物催化功能的分子量适中的蛋白质,具有极高的催化效率、高度的特异性及控制的灵敏性。大多数酶是水溶性的。由于酶催化反应具有底物专一性、催化高效性、反应条件温和等优点,符合绿色化学的要求,从而被大家高度重视,已在许多领域得到了广泛的应用。但是,人们也逐渐注意到了它的不足之处: 酶的稳定性差,容易失活; 酶催化反应过后,与反应体系混在一起,难于回收,不利于连续化生产; 产物分离纯化困难,产品成本较高。有鉴于此,人们一直都在不断地研究如何在克服传统酶技术的缺点的前提下利用酶的技术,固定化酶就是人们在寻求克服这些不足的过程中不断改进发展起来的一项技术。1. 固定化酶的制备技术 固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。1.1 传统固定化技术1.1.1吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为物理吸附法,简称吸附法。吸附法包括物理吸附和离子结合法。工艺简便和条件温和是该方法显著的优点,可供选择的载体涉及天然或合成的无机与有机高分子材料,有时酶的纯化与固定化也可同时实现。因酶分子与载体之间的共价结合而呈现良好的稳定性及重复使用性,共价结合法是目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。物理吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。吸附法制备固定化酶,操作简便,条件温和,不会引起酶的变性失活,载体价廉易得,而且可反复使用。但酶与载体的结合不牢易于脱落,所以它的使用受到一定的限制。但是,吸附法中由离子键、氢键、偶极键及疏水键固定的酶易反应介质的pH、离子强度等的影响而从载体上脱落。1.1.2包埋法将酶或酶菌体包埋在多孔载体中使酶固定化的方法称为包埋法。包埋法分为网格型和微囊型两类,其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。包埋法专用的载体主要有:明胶.、聚酰胺、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠、火棉胶等。1.1.3结合法选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起而制成固定化酶的方法,称为结合法。根据酶与载体结合的化学键的不同,结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。离子键结合法通用的载体是各种离子交换剂,用离子键结合法制备的固定化酶,操作简便,活力损失少,但是结合不牢固,在pH 值和离子强度等条件变化时,酶容易脱落。共价键结合法常用的载体有:纤维素. 琼脂糖凝胶.葡聚糖凝胶. 甲壳素. 氨基酸共聚物,甲基丙烯酸共聚物等。用共价结合法制备的固定化酶,结合牢固,酶不易脱落,可连续使用相当长的时间。但载体的活化操作比较复杂,因为结合法有较激烈的反应而使酶活力损失较大。结合法制备固定化酶所用的高分子载体带有强的反应基团,如重氮盐、醛、酰氯、活性酯等活性基团,以保证酶的固化过程得以在比较温和的条件下进行。常用的载体有重氮化聚苯乙烯、缩醛类聚合物、聚酰胺等。近年来,固定化酶的载体研究发展很快,已产生几大类别的载体。可分为有机高分子载体、无机载体和复合载体。在有机高分子载体中,天然高分子凝胶载体一般无毒性,传质性能好,但存在强度较低、在厌氧条件下容易被细菌分解和寿命短等问题。常见的有琼脂,海藻酸钠,明胶等。近年来新兴起的新载体是甲壳素和壳聚糖。而合成高分子凝胶载体一般强度较大,但传质性能较差,会对酶的活性产生影响。常见的载体有聚丙烯酰胺和聚乙烯醇等。近年来,人们又合成出许多具有优良性能的新载体。1.2 传统固定化技术的改进保持各种传统固定化方法的优点并改进其不足一直是固定化酶方面研究的重要内容。将酶吸附于离子交换树脂上后,再用多官能基化合物交联可提高固定化胰蛋白酶的活性及稳定性。在有硫酸铵或水溶性聚乙二醇存在时,会大幅度提高疏水性载体对酶的吸附率;在底物反应液中加入维生素C(Vita2min C) 时,可提高固定化葡萄糖氧化酶的使用性能;调节pH 值,则能使酶固定化及固定化酶处于一个最佳的微环境中。戊二醛类双官能团偶联剂的一端保护后活化载体,再脱保护并固定化酶时可大幅度提高酶活力的回收率。这些研究结果表明,通过改进传统固定化方法而改善固定化酶的性能是可行的。2.固定化酶的应用随着酶固定化技术的发展,固定化酶的应用范围不断扩大。目前它已应用于化学及化工领域、食品及环境废水处理等方面。2.1 固定化酶在化学及化工领域中的应用研究水解蛋白酶固定化后可用于肽及有机化合物的 酶促合成,如硅藻土固定化木瓜蛋白酶可在乙酸乙酯介质中催化合成Leu - 脑啡肽前体Boc - Phe - Leu-OMe、产率高达90 %以上;固定化嗜热菌蛋白酶可高产率及专一性催化合成高甜度低热量的二肽甜味剂Aspartame 的前体Z - L - Asp - L - Phe - OMe 、并可同时实现天冬甜精的生物合成与DL -苯丙氨酸甲酯的光学拆分 。通过反相悬浮聚合制备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备、且具有潜在的应用前景。脂肪酶既能催化天然油脂及酯类的水解,也能在有机介质中催化酯的合成、交换、氨解及肽合成而具有重要工业价值, 故固定化脂肪酶的研究颇受重视。固定化酶在化学及化工领域中的应用研究也是人们感兴趣的课题,通过反相悬浮聚合制备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备,且具有潜在的应用前景。 2.2 在食品行业的应用固定化氨基酰化酶是世界上第一种用于工业化生产的固定化酶。1969 年,日本就将它用于拆分DL - 氨基酸,连续生产L - 氨基酸,其生产成本仅为流离酶生产成本的60 %。淀粉酶及糖化酶能催化淀粉转化为葡萄糖,是较早研究并仍在研究的固定化生物催化剂。将糖化型淀粉酶吸附在二乙氨乙基纤维素上,以此固定化酶为催化剂并悬浮在30 %的淀粉溶液中,在55 下搅拌水解,几乎可定量连续地得到葡萄糖溶液。淀粉酶及糖化酶能催化淀粉转化为葡萄糖,是较早研究并仍在研究的固定化生物催化剂,- 淀粉酶与糖化酶的共固定化实现了淀粉的液化与糖化两步反应的合二为一、淀粉一步水解为葡萄糖且操作半衰期可达920 h ,而当- 淀粉酶、糖化酶及葡萄糖异构酶共固定化时又可使淀粉转化果糖。不仅如此,酶尚可与细胞等其它生物分子构成共固定系统。两种或多种有联系的酶共固定化构成更为复杂的生物转化系统、却又能将复杂的生物反应过程简单化,这是一种颇具新意的研究思路。其次,淀粉及纤维素是地球上贮量丰富的可再生资源,通过固定化酶催化水解实现其高附加值转化符合社会经济可持续发展的时代要求,如固定化蜗牛酶就对纤维素的降解具有良好的酶催化活性。 2.3 固定化酶在皮革工程领域的应用展望皮革工程是经过一定的处理过程,将原料皮中的可溶性蛋白质、毛、脂肪、弹性蛋白和网硬蛋白等非制革成分去除掉,加入所需要的鞣剂、复鞣剂、加脂剂等材料以提高其使用性能,满足人们的各种需要的过程。由于酶具有较好的专一性、温和性和高效性等生物催化特性,在制革的过程中已有许多工序(浸水、浸灰、脱脂和软化等) 得到应用,在高档皮革的制造过程中则更为如此。在皮革工业废水的处理及固体废弃物的资源化与有效利用方面,酶更是得到了广泛的应用。但是,目前在皮革工业中采用的酶处理方法也存在着以下的缺点: 酶的稳定性差,容易失活; 酶催化反应过后,与反应体系混在一起,难于回收,不利于连续化生产; 产物分离纯化困难,产品成本较高。因此,有必要在固定化酶在皮革工程领域的应用方面进行一些研究工作：2.3.1在皮革生产中的应用在皮革的生产中,在传统的酶处理后应尽快转入下一道工序。例如,在浸水、浸灰、脱脂和软化等达到预期的目的之后,都要尽快地转入下一道工序。否则,其中的酶还存在一定的活性,还会对皮坯进行作用,影响产品的质量。如果在皮革的生产过程中采用磁性固定化酶技术,在酶处理达到预期目的之后,将其中的酶完全回收。一方面,酶还可以继续使用,有一定的经济效益;另一方面,皮革中已没有酶,不会在没有转入下一工序之前继续作用,影响皮革的质量,有利于皮革产品质量的控制。2.3.2在皮革工业污水处理中的应用在皮革工业污水处理中,往往要用到生物曝气法。其原理是在生物细胞内酶的催化作用下产生氧化分解作用。污水中溶解性的物质透过细胞壁,在胞内酶的催化作用下,迅速完成氧化、合成一系列生化反应;被吸附在细胞壁周围的污水中的固体物质,则由细菌分泌出的胞外酶将其转化成可溶性物质,再渗入细胞壁,由胞内酶去进行生化反应。一部分有机物被氧化分解为二氧化碳、水、氨等,并放出能量,另一部分有机物则转化为生物体所必需的营养物质,组成新的原生质,通过这一过程,污水中的COD、BOD、色度等都得到降低,污水得到净化。如果在皮革污水处理池中设置一固定化装置,采用现代技术将处理污水所必需的生物酶固定在其表面上,在污水处理的过程中,随着污水的运动,这些酶就可以与其中的有机物进行广泛的接触而发生所需要的生物化学反应,达到净化污水的目的。在处理的过程中,固定化酶还可以一直使用下去,而其活性也不会降低。2.3.3在皮革工业固体废弃物的资源化与有效利用方面近年来,中国的皮革工业得到了迅猛的发展,在创造极大的经济效益的同时,也造成了对环境的污染和资源的浪费等问题。在皮革废渣中,存在着大量的胶原蛋白质。胶原蛋白具有恰当的氨基酸组成和特殊的性质,在化妆品、食品、医药卫生等领域具有广阔的应用前景,从皮革工业废弃物中提取胶原蛋白质资源已逐渐成为人们研究的热点之一。在从废皮屑中提取胶原蛋白的最有效方法是酶处理法,这是因为酶具有较好的专一性,可以控制产物的分子量与分子量分布。但是,传统的酶处理法又存在着一定的问题:酶无法回收,如果没有完全失活,还会在以后继续作用;在产品中存在酶,产品的纯度低。如果能够采用固定化酶的技术,在对皮革工业废弃物进行处理时,将酶固定于反应釜的器壁、搅拌叶片等位置上,即可解决这一问题;也可以采用磁化固定化酶技术解决这一问题。*结束语近年来酶的固定化及应用研究已得到长足进展,开发新型固定化技术、改进传统固定化方法和注重天然高分子载体改性是酶固定化研究的主要趋势。生物学及生物工程、医学及生命科学仍是固定化酶应用的重要场合,适于化学化工及环境科学领域应用的固定化酶具有生态环境材料的鲜明特征、应给予足够重视。在皮革工业中,固定化酶技术也具有广阔的应用前景。 参考文献：1蒋治良,莫琪,李森,等1 酶的固定化及应用J 1 广西化工,1994 ,23 (3) :18 - 2312李彦锋,李军荣,伏莲娣1 固定化酶的制备及应用J 1 高分子通报,2001 :13 - 2313陈陶声,居乃琥,陈石根1 固定化酶理论与应用M1 北京:北京轻工业出版社,19871 4林健巧,王炜军,穆虹,等. 烟草多酚氧化酶的分离与固定化技术研究J . 中国生物化学与分子生物学报,1999 ,15 (4) :663.5 徐晖,王燕,魏密苏. 环境工程中固定化酶与固定化微生物的应用J . 沧州师范专科学校学报,2002 ,18(3) :42. 6曹国民,黄杰,高广达. 蚕丝固定化脂肪酶的研究J . 生物工程学报,1997 ,13 (1) :88.7张所信,王为国,江龙法,等. 球形交联壳聚糖的制备及其在固定化- 淀粉酶方面的应用J . 现代化工,1997 ,17 (4) :29.8姜梅,王善荣,季勤. 壳聚糖膜固定化葡萄糖氧化酶的特性研究J . 食品科学,2003 ,24 (4) :38 - 41.