BIOSEP10蛋白质沉淀法.ppt

蛋白沉淀法与饮食文化,1）、豆腐的由来：“来其”、“黎其”，汉朝淮南王刘安 2）、一人得道，鸡犬升天,问题,问题： A、1941-12-7, 7:59am 珍珠港事件 - 烧伤 - 蛋白流失，感染 B、急性肾炎 - 蛋白流失 人血清白蛋白,第十二章 蛋白质沉淀法,1、概述 2、蛋白质溶解 3、蛋白质溶液的稳定因素 4、蛋白质沉淀方法分类 5、盐析法 6、|pH水 pI| Value调节法 7、有机溶剂沉淀法 8、亲水聚合物沉淀法 9、沉淀动力学 10、Applications,1 概述,定义 常用加入试剂的方法，改变溶剂和溶质的能量平衡来降低其溶解度，使产物离开溶液生成不溶性颗粒，沉降析出。沉淀具有浓缩与分离的双重作用。 与结晶联系 在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在化学反应的沉淀或结晶。 区别 结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出。,1 概述,优点 A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有利，收率越高； B、原料液体积很快地减小1050倍，从而简化生产工艺、降低生产费用； C、使中间产物保持在一个中性温和的环境； D、及早地将目标pro.从其pro.水解酶分离出来，避免pro降解，提高产物稳定性； E、用沉淀法作为pro色谱分离前处理，可使使用色谱分离的限制因素降低到最少。 缺点： A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低； B、过滤较困难,2 蛋白质溶解,蛋白质溶解：相似者相溶 aa的亲水性和疏水性： 有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水aa所占的%等。如白蛋白 不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水aa所占的%等。如纤维蛋白原。,3 蛋白质溶液的稳定因素,1)、水化层(hydration shell) tight hydration shell(0.35g water/1g pro) loose hydration shell(2g water /1g pro) 2)、静电排斥 zeta电势 Nernst Potential胶核表面电位(不可测) Stern Potential(不可测) Potential滑面电位(可测,mobility) 电位 Nernst电位 ionic strength 3)、|pH水 pI| Value |pH水 pI| Value zeta电势 水化层 静电排斥,Tight hydration shell Protein core Loose hydration shell,4 蛋白质沉淀方法分类,1）、盐析法 2）、有机溶剂沉淀法 3）、 |pH水 pI| Value调节法 4）、亲水聚合物沉淀法 5）、聚电解质絮凝法 6）、高价金属离子沉淀法 7）、亲和沉淀法,5 盐析法,机理：A、zeta potential；B、hydration shell,5 盐析法,计算: Cohnx经验公式 式中, S为蛋白质的溶解度(g/L)；I为离子强度；m为盐的摩尔浓度；值为蛋白质在纯水中(I=0时)的假想溶解度对数值，是pH值和温度的函数，在蛋白质pI时最小；Ks为盐析常数，与温度和pH值无关。,5 盐析法,方法: A、 “Ks”分级盐析法：在一定pH值及温度下，改变盐浓度（即I）达到沉淀的目的。 B、“”分级盐析法：在一定I下，改变溶液的pH值及温度达到沉淀的目的。 C、应用：一般的初步分离用第一种方法，进一步纯化时用第二种方法。,5 盐析法,影响因素 A、无机盐种类 感胶离子序(Hofmeister序列): In 1888，Hofmeister对一系列盐沉淀蛋白质的能力进行了测定研究。 阴离子排序为：柠檬酸根3- 酒石酸根3- F- IO-3 H2PO-4 SO-4 CH3COO- Cl- ClO-3 Br- NO-3 ClO-4 I- CNS-; 对阳离子排序为： Th4+ Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+,5 盐析法,结论： a 不同种类的盐主要影响Ks； b 离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。 无机盐的挑选原则： a 较高的盐析效能； b 高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液； c 溶解度受温度的影响小； d 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离； e 不易引起蛋白质的变性； f 价格低廉； 最常用(NH4)2SO4。优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。 次常用Na2SO4。缺点：在400C以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。,5 盐析法,B、无机盐添加方式,5 盐析法,C、温度T 主要考虑不能影响主要产物的活力,即在其稳定的温度下盐析,可通过实验决定,一般来说,温度越低,形成沉淀越不易,但也有相反的情况.实际上,盐析的温度范围较大,所有一般都在常温下盐析.,5 盐析法,D、溶液pH pH影响Cohnx方程中的值。 见图 图有何用？,6 等电点沉淀法,等电点沉淀法中的pH值作用于值而隐含在Cohnx公式中，pI值通常在pH46范围内变化，一般用无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸）作沉淀剂。 在蛋白质疏水性比较大和结合水比较小时这种类型的沉淀更有效。为了提高等电点法的沉淀能力，常将其与盐析法、有机溶剂法或其他沉淀法一起使用。 最大缺点：无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性的危险。,7 有机溶剂沉淀法,同盐析一样，随着沉淀剂有机溶机浓度的上升，蛋白质溶解度也呈指数规律下降。 式中, So为当（K/e2） 0时S的外推值；e为水-有机溶剂混合物的介电常数；K为常数(水的介电常数的吸收系数)。,7 有机溶剂沉淀法,有机溶剂的种类： 丙酮(首选)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀pro。 机理： A、有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后，会使水溶液的介电常数降低，而使pro分子间的静电引力（库仑力）增大，导致凝集和沉淀。 B、有机溶剂使pro溶剂化，使原来与pro结合的水被溶剂所取代，从而降低了pro溶解度。这种理论不能说明为什么乙醇比丙酮的亲水性强，丙酮却比乙醇沉淀pro的能力强，也解释不了丙酮、乙醇之类溶剂在所谓脱去pro水膜的过程中容易造成pro变性，而盐析脱水时不造成pro变性。 C、丙酮、乙醇等不仅是pro的沉淀淀剂，而且还是一种变性剂，可见作用有机溶剂使pro在沉淀和变性之间既有区别又相关联。,7 有机溶剂沉淀法,影响因素及控制 A、T：当乙醇与水混合时，会放出大量的稀释热，使溶液T显著升高，对不耐热的pro影响较大。解决办法：搅拌、少量多次加入，以避免温度骤然升高损失pro活力。另一方面温度还会影响有机溶剂对pro的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全，所以在乙醇沉淀人血浆蛋白时，温度控制在-10C下进行。 B、乙醇：通常随乙醇上升，pro溶解度下降。如血纤维蛋白原的最大溶解度在乙醇浓度为8%时达到最大，而当乙醇浓度为40%时达到最小。 C、pH值：在确定了乙醇以后，pro最低溶解度出现在蛋白.的pI处，因此可以通过调节pH值来选择性分离蛋白质。 D、pro：避免使用很稀的浓度，因pro在高浓度下才较稳定。,7 有机溶剂沉淀法,优点： A、某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度较高， B、从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂； 缺点： A、耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦； B、且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性； C、收率也比盐析法低； D、试剂易燃，有毒。,8 非离子型聚合物沉淀法,某些聚合物，如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等，具有沉淀蛋白质的作用。其中最常用的是PEG，相对分子质量从200D到20KD的不同聚合程度的产品都是有效的，通常在蛋白质沉淀中使用PEG-6000或PEG-4000。 计算公式： 式中，S-溶解度；c-PEG浓度；-常数，受溶液条件的影响(如pH值和离子强度)；K-常数，由pro大小和PEG的类型决定。 适应条件：上式适用性广，但在低浓度蛋白质，如1.5g/L和高浓度蛋白质，如75g/L和150g/L时，实验结果会偏离线性。这时方程需校正,8. 非离子型聚合物沉淀法,8. 非离子型聚合物沉淀法,优点： A、体系的温度只需控制在室温条件下； B、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集； C、PEG非但不会使pro变性,而且可以提高它的稳定性； D、PEG无毒，优先使用在临床产品的加工过程中被。 缺点： A、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用超滤和液-液萃取来解决； B、价格较昂贵。,9. 沉淀动力学,溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起： A、热运动（Brownian运动）； B、对流运动，由机械搅拌产生； C、差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。 第A、B两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，第种机理在沉降过程中起主导作用(如在废水处理中)。 异向聚集：由Brownian运动所造成的碰撞导致。 同向聚集：而由对流运动所造成的碰撞导致。,9. 沉淀动力学,沉淀过程步骤： A、初始混合，蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混合； B、晶核生成，新相形成，产生极小的初始固体微粒； C、扩散限制生长，晶核在Brownian扩散作用下生长，生成亚微米大小的核，这一步速度很快； D、流动引起的生长，这些核通过对流传递（搅拌）引起的碰撞进一步生长，产生絮体或较大的聚集体，这一步是在较低的速度下进行的。 E、絮体的破碎，破碎取决