利用微卫星多重PCR和带型分析鉴别酿酒酵母菌株.ppt

利用微卫星多重PCR和带型分析鉴别酿酒酵母菌株,Discrimination of Saccharomyces cerevisiae wine strains using microsatellite multiplex PCR and band pattern analysis Food Microbiology 25(2008) 56-54,现代的酿酒学家发现用不同的酵母菌株发酵可以使葡萄酒产生不同的特点。这导致了具有多种特色并可以应用于不同领域的选育菌株工业生产化。现在市场上提供了几百种葡萄酒菌种，它们几乎都属于酿酒酵母菌属。 与此同时，人们对发明快速而且精确检测酵母菌株的方法也产生了兴趣。在葡萄酒酿造中，它的应用包括确定接种菌株对在未发酵葡萄汁中野生菌株的显性优势，实时记录发酵中的菌株动态过程，控制菌株生产的质量并鉴别无效菌株。酿酒时，选育出的菌株被接种于富含野生酿酒酵母和非酿酒酵母的葡萄汁中。快速鉴别酵母菌株的方法应该考虑到菌群生长动态的观察，选育菌株的显性优势和环境因素对酵母菌株的影响。,微卫星位点PCR高辨别能力以及其稳定性和实用性使其成为区分酵母菌种最受欢迎的方法之一。这个方法用于常规检测的瓶颈发生在扩增子分析的步骤：利用聚丙烯酰胺凝胶及测序分析仪确定扩增子的大小较为费时费力。为了避免这个限制，有人提出利用简单的高张力琼脂糖凝胶电泳。最近，Howell 等人建议利用对SC8132X 位点的PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶加EB染色电泳来进行酿酒酵母的分型。 为了建立一种快速精确并且甚至适用于那些低预算高通量实验室的鉴别菌种的方法，我们对3个高多态性微卫星位点的多重扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳进行带型分析。 然后，我们在测试发酵温度对共接种的两个选育菌株的生长速率和竞争能力的影响的实验中检查了这种方法的实际适用性。,相关概念,微卫星，microsatellite，一般是指由短的(16bp)基元组成的较低程度的串联重复,以在基因组的多个位点上分散分布为特征,最短的基元分布的位点数最多。微卫星寡核苷酸的重复次数在同一物种的不同基因型间亦存在很大差异，可以用来进行菌株的鉴别。,酿酒酵母菌株，采购于酿酒酵母生产商。悬浮于无菌5%的蔗糖液体培养基中，40摄氏度下放置30分钟，稀释，然后涂布于YMA平板，然后在24摄氏度下培养48小时。,实验中用到的酵母菌株,主要实验手段,DNA抽提 （Harju等人（2004）的方法抽提DNA） PCR扩增 （三个微卫星位点SC8132X,YOR267C和SCPTSY7被使用，是由于他们具有高度的多态性） 电泳 （琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺电泳。分布情况被集群分析软件处理，该软件使用一种类似于二进制的指标，它使用UPGMA的方式创建系统树图） 通过对每个菌株取五份菌落DNA萃取液进行扩增来检测可重复性，对扩增产物的分析是将其分为五个不同孔道进行琼脂糖电泳而进行的。,主要实验手段,发酵 两株酵母菌株，DSM Cepage Chardonnay和Vitilevure DV10被选中进行发酵试验，灭菌的葡萄汁被用于培养基。它包含浓度均为150mg/L的硫酸铵和磷酸铵作为发酵氮源。浓度为200g/L的蔗糖被加入作为糖源。发酵开始时将1.6L灭菌的葡萄汁加入到容积为2L的带有磁力搅拌器的锥形烧瓶中。 以单菌株涂平板，再挑出单菌落以多元的PCR分析方法检测它们的同一性。然后将相同的菌落悬浮培养于预配的培养基中，该培养基由灭菌的葡萄汁组成，可以提供氮源但无糖源。在20下进行每分钟震动100次的好氧生长后，形成混合的接种物，每个菌株都具有均一的浓度，为5*105个细胞/L。由浓度为1*106个细胞/L的单菌株形成的接种物用来检测每种菌株完成发酵的能力。发酵温度被控制在15-20之间，并且设有条件相同的对照