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项目编号：甘肃中医学院药学系毕业论文课题名称 红芪多糖抗肝纤维化的药效学研究 专业年级 药物制剂2007级 课题组人员 郭倩 指导教师 韩涛 甘肃中医学院药学系二0一一年编制红芪多糖抗肝纤维化的药效学研究药物制剂2007 郭倩指导老师 韩涛摘 要：目的：研究红芪多糖抗肝纤维化的作用，证明红芪多糖在抗肝纤维化方面的使用价值。方法：雌雄各半Wistar大鼠84只，随机分成七组，每组十二只，分别为空白对照组，模型组，黄芪多糖对照组，红芪水煎液对照组和红芪多糖低剂量组、中剂量组、高剂量组。实验采用二甲基亚硝胺对大鼠进行急性小剂量间歇性腹腔注射3周，制作大鼠实验性肝纤维化模型。造模成功后，各实验组以不同实验药物灌胃给药，4周后对各组肝纤维化大鼠肝组织中透明质酸（HA）、型胶原(-C)、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（PCIII）、羟脯氨酸（Hyp）五项指标进行测定，以反映肝细胞损伤及肝纤维化的程度。结果：红芪多糖组治疗后大鼠肝组织HA、-C、LN、PCIII、HYP水平明显低于模型组，差异有显著性；红芪多糖高、中剂量组能显著降低肝纤维化大鼠肝组织HA、-C、LN、PCIII、HYP的水平，能明显改善实验大鼠肝纤维化程度。结论:红芪多糖对实验性肝纤维化具有一定的治疗作用。关键词：红芪多糖（HPS）；二甲基亚硝胺(DMN)；肝纤维化；羟脯氨酸（Hyp）； 6 药用黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.var.mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根。黄芪是常用的补益类中药, 始载于神农本草，具有补气固表,利尿消肿,排毒,敛疮生肌之功。现代研究表明,黄芪对肝细胞的免疫损伤有保护作用,可促进肝细胞再生,同时有抗肝纤维化作用,可使已形成的肝纤维化得到较好的改善和逆转。红芪与黄芪功效相近，红芪多糖为其主要成分，历史上常作为黄芪的代用品。本实验研究了红芪多糖对大鼠肝纤维化的药理作用，探究红芪多糖对肝纤维化的治疗作用。1. 实验材料1.1 药品：红芪多糖、黄芪多糖、红芪水煎液（每ml相当于生药材0.27g）（甘肃中医学院药化实验室）；二甲基亚硝胺（天津市化学试剂研究所）；大鼠ELISA试剂盒(RD)；生理盐水（四川科伦药业股份有限公司，C11022108-1）。1.2 仪器：多功能时间分辨荧光免疫分析系统(芬兰 wallac VICTOR2 1420)；离心机（上海手术器械厂，80-1型）。1.3 动物：Wistar大鼠，雌雄兼用，体重为20020g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2004-0006。2.方法2.1 实验分组：取Wistar大鼠84只，雌雄各半，随机分成七组，每组十二只，分别标记。分别为空白对照组，模型组，黄芪多糖对照组，红芪水煎液对照组，红芪多糖低剂量组、中剂量组、高剂量组。2.2 模型建造：按文献方法，用生理盐水将二甲基亚硝胺稀释至浓度为1%，除空白对照组外，对其余大鼠腹腔注射DMN稀释液1ml/kg体重，每天1次，连续3天，空白对照组腹腔注射等剂量生理盐水，共3周。2.3 给药：造模成功后，黄芪对照组灌胃给药黄芪多糖300mg/kg体重；用红芪多糖对低剂量组、中剂量组、高剂量组分别灌胃给药150mg/kg体重、300mg/kg体重、600mg/kg体重；红芪水煎液对照组灌胃给药2.7g/kg体重；模型组、空白对照组用生理盐水10ml/kg体重进行灌胃给药，每天1次，共4周。2.4 标本采集：最后一次给药后，将肝纤维化大鼠禁食12h后颈椎脱臼处死,剖腹取肝脏观察大体外观后,用冷生理盐水洗涤，滤纸吸干水分，准确称取肝脏0.5g置于组织匀浆器中，加9倍量生理盐水制备成10%的肝组织匀浆，3000r/min离心10min，-20保存待测。2.5 指标检测：采用酶联免疫法用ELISA试剂盒对透明质酸（HA）、型胶原(-C)、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（PCIII）、羟脯氨酸（Hyp）进行测定。3.数据处理：各组大鼠肝纤维化指标测定数据均以s表示，采用SPSS14.0统计软件处理，用两个独立样本的t检验对数据进行统计分析，显著性标准为P0.05。4.结果：4.1 DMN染毒期间观察可见,大鼠生长减慢,精神萎靡,反应迟钝,活动减少,饮食下降,粪便稀薄,皮毛皱而不洁，缺乏光泽。与模型组相比较，红芪多糖组、黄芪多糖组、红芪水煎液组各项生理体征恢复较快。4.2 各组实验大鼠肝纤维化指标的比较（见表1）：4.2-1 HA: 各实验组肝纤维化大鼠肝脏的HA水平均低于模型组（P0.05），其中，红芪多糖高、中剂量组和黄芪多糖组治疗后肝纤维化大鼠HA水平明显低于模型组,差异有非常显著性( P 0. 05）；红芪多糖低剂量组和红芪水煎液组之间存在显著差异（P0.05），提示红芪多糖高剂量组具有明显减轻肝脏损伤和肝纤维化程度的作用，红芪多糖中剂量组和黄芪多糖组减轻肝脏损伤和肝纤维化程度的作用较明显且能力相当。4.2-2 -C：红芪多糖高剂量组和中剂量组之间具有显著性差异（P0. 05）；红芪多糖低剂量组与红芪水煎液组的-C水平无显著性差异（P0. 05），提示红芪多糖高剂量组能较好的减轻肝纤维化的程度，提高基底膜胶原的更新率和活动性。4.2-3 LN：表1显示，各实验组肝纤维化大鼠肝脏的LN水平明显低于模型组（P0.05），其中，红芪多糖高剂量组的LN水平明显低于模型组，差异有非常显著性( P0.05)；红芪多糖高剂量组与红芪多糖中剂量组差异具有显著性( P0. 05），与红芪多糖低剂量组与红芪水煎液组的LN水平具有显著性差异（P0. 05），提示红芪多糖高剂量组能显著降低肝纤维化程度，具有良好抗肝纤维化作用。4.2-4 PCIII：各实验组肝纤维化大鼠肝脏的PCIII水平明显低于模型组（P0.05），其中，红芪多糖高剂量组的PCIII水平明显低于模型组，差异有非常显著性( P0. 05），与红芪多糖低剂量组与红芪水煎液组的PCIII水平具有显著性差异（P0. 05），提示红芪多糖高剂量组和中剂量组能明显减轻纤维化早期肝功能的损伤程度。4.2-5 Hyp：表1显示，红芪多糖高剂量组的Hyp水平明显低于模型组，差异有非常显著性(P0. 05）；红芪多糖高剂量组与红芪多糖中剂量组差异具有显著性( P0. 05），与红芪多糖低剂量组与红芪水煎液组的Hyp水平具有显著性差异（P0. 05）；红芪多糖低剂量组和红芪水煎液组之间存在显著差异（P0.05），提示红芪多糖高剂量组具有明显减轻肝纤维化病变程度的作用，红芪多糖中剂量组和黄芪多糖组减轻肝脏损伤和肝纤维化程度的作用比较明显且能力相当。表1 各大鼠肝纤维化指标的测定结果(s) n HA（ng/ml） -C (ng/ml) LN(ng/ml) 空白对照组 12 13.282.24* 1.090.26* 3.290.81* 模型组 8 32.309.54 2.920.38 8.601.35 红芪多糖高剂量组 10 16.581.39* 1.440.31* 3.541.15* 红芪多糖中剂量组 10 18.202.38* 1.960.53* 5.361.64* 红芪多糖低剂量组 9 26.020.33* 2.630.66 6.931.82* 黄芪多糖组 10 18.321.63* 2.140.57* 5.411.27* 红芪水煎液组 9 24.644.65* 2.360.41* 6.681.45* 注：与模型组比较*P 0. 05，与红芪多糖中剂量组比较P 0. 05，与黄芪多糖组比较P 0. 05，与红芪水煎液组比较P 0. 05。 n PCIII(ng/ml) Hyp(ng/ml)空白对照组 12 1.880.43* 15.331.36*模型组 8 6.821.48 43.976.84红芪多糖高剂量组 10 2.030.59* 18.093.86*红芪多糖中剂量组 10 2.860.43* 25.374.71*红芪多糖低剂量组 9 5.471.16* 39.858.84黄芪多糖组 10 3.250.82* 26.765.27*红芪水煎液组 9 4.230.66* 32.514.49*注：与模型组比较*P 0. 05，与红芪多糖中剂量组比较P 0. 05，与黄芪多糖组比较P 0. 05，与红芪水煎液组比较P 慢性活动性肝炎慢性迁延性肝炎。故HA水平可反映肝脏损伤和纤维化程度。（参考值：正常人165ng/ml，肝硬化250ng/ml）2.型胶原(-C)：是一种网状结构，是构成基底膜的主要成分。肝纤维化时，肝组织及血清中型胶原含量明显增高，其含量与肝纤维化程度呈正相关。它是反映基底膜胶原更新率和活动性的最佳指标。（参考值：正常人140ng/ml）3.层粘连蛋白(LN)：是基底膜成分中的主要糖蛋白。在肝内与型胶原共同分布。肝硬化时，LN大量沉积，血清中LN水平与型胶原HA呈正相关。LN对判断肝纤维化的敏感性、特异性分别为63%和98%。（参考值：正常人115.7ng/ml，慢性肝病140ng/ml，肝硬化160ng/ml）4.III型前胶原(PCIII)：全称III型前胶原氨基端肽。III型前胶原主要告知慢性肝纤维化的活动性，在纤维化早期肝功能损伤时，PCIII即可上升。（参考值：正常人10ng/ml） 5.羟脯氨酸（Hyp）：是胶原蛋白所特有的氨基酸，测定Hyp含量可明确胶原蛋白总体水平，是评定肝纤维化病变的程度的直接指标。目前抗肝纤维化西药多处于实验研究阶段，且其副作用较大，真正能用于临床的极少，中药防治肝纤维化具有多环节、多靶位、多途径且毒副作用小的优势，顺应肝纤维化的发病机制及防治原则，日益显示出防治效果上的优势，已成为肝病研究治疗的热点课题。在不少中药抗肝纤维化的研究中,发现了一些中药及其有效成分具有良好的抗肝纤维化作用,显示出中药防治肝纤维化的广阔前景。一些单体如甘草甜素、苦参碱、川芎嗪等已试用于临床,效果较为满意。 中药红芪是豆科植物多序岩黄芪（Hedysarum polybotrys Hard-Mazz）的干燥根,常作为黄芪的代用品，为甘肃特产名贵药材，在临床上主要用于补气固表, 利尿托毒, 排脓, 敛疮生肌。红芪多糖（Hedysarum polysaccharide ，HPS）为其主要成分，现代药理研究指出，红芪具有促进机体免疫功能的作用，红芪多糖可以提高特异性免疫力和非特异性免疫力，并对实验性肝损伤有一定的保护作用。因黄芪与红芪功效相似，药效无太大差异，因此，临床上常将红芪与黄芪通用，加之其分别含有红芪多糖与黄芪多糖，所以，本实验中选择黄芪多糖作为对照药物。近年来研究发现，红芪多糖的活性成分具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、治疗糖尿病等作用。红芪及其多糖成分对集体免疫功能也有显著促进作用。故此，本实验通过红芪多糖增强免疫、固表补气的作用对红芪多糖抗纤维化的作用进行研究。通过本实验研究证实，红芪多糖高剂量组和中剂量组对DMN肝损大鼠HA、-C、LN、PCIII、HYP水平的升高有明显抑制作用，以红芪多糖高剂量组效果尤为明显，表明红芪多糖对肝细胞的免疫性损伤具有良好保护作用,对肝纤维化有良好治疗效果,显示出较好的开发与应用前景，为进一步开发红芪的药用价值提供了一定的依据。今后还应加强其抗肝纤维化作用机制方面的研究, 为临床应用提供理论依据。参考文献：1戚心广,稻垣.丹参、黄芪对实验性肝损伤肝细胞保护作用的机理研究J.中西医结合杂志,1991,11(2):102- 1042马红, 王宝恩, 陈翌阳,等.黄芪对免疫损伤性肝纤维化大鼠的治疗作用J.中西医结合肝病杂志,1997,7:32-353金树根，王灵台，程建杰，等.二甲基亚硝胺对大鼠肝纤维化的造模研究，中西医结合肝病杂志，1994,(4）：1.4孙玉凤,崔东来,姚希贤.中西医结合抗肝纤维化的研究现状与进展 J.中国中西医结合脾胃杂志, 2000,8(4):254-2565孙玉凤,姚希贤,蒋树林.肝纤维化的中医中药治疗J.世界华人消化杂志, 2000, 8(6):686-6876中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南J.中华肝脏病杂志,2005,13：881-8917贾克明.加强对乙型病毒性肝炎治疗的研究J.中华内科杂志,2000,39 (12):797.8王泰龄,王宝恩,张怀