生产管理知识_酶法生产低聚木糖的研究论文

贵州大学 硕士学位论文 酶法生产低聚木糖的研究 姓名：胡晓瑜 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：周文美 20080501 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 功能性食品的研究与开发给食品工业注入了全新的内容，而生产功能性食品 的关键是功能性食品基料即生理活性物质的制备。功能性低聚糖因具有独特的生 理功能，特别是能促迸肠道内双歧杆菌的增殖，有益于肠健康而成为一种重要的 功能性食品基料，并己引起全世界的广泛关注。低聚木糖作为一种新型功能性低 聚糖已成为食品工业研究开发的热点之一。 本课题为获取低聚木糖，从菌种筛选、粗木聚糖生产、木聚糖酶制备、低聚 糖的生产各工艺阶段进行了探讨，以期为低聚木糖的生产研究做出贡献。研究中 首先采用了7 种待测菌种作为木聚糖酶的生产菌，优化了粗木聚糖的制备条件， 采用透明圈法和D N S 法测定了各种菌的产酶活性。获取适宜木聚糖酶生产菌种， 优化了产酶时程、氮源、p H 值，并研究了温度对产酶过程的影响；初步确定了菌 种的发酵条件。纯化木聚糖酶后利用玉米芯生产的粗木聚糖和木聚糖酶生产低聚 木糖。最后对低聚木糖进行提取纯化，薄层层析法测定了低聚木糖成分。 本课题主要内容为： 1 ) 比较了三种球毛壳菌、一种血红毛壳菌、一种舟形毛壳菌，以及米曲霉和白曲 霉等7 株菌种的产酶效果。结果表明，米曲霉、血红毛壳 ( C h a e t o m i u m c r u e n t u m ) b o b 2 0 - 1 和球毛壳菌A C C C 3 0 5 6 6 有较好的产酶效果， 本课题主要以球毛壳菌A C C C 3 0 5 6 6 作为产木聚糖酶的菌种。 2 ) 通过单因素及正交实验，得出了粗木聚糖制备的最优条件：6 0 浸泡1 h ，冷藏 8 h - 1 0 h ，乙醇洗涤用量为木聚糖溶液的2 - 3 倍。 3 ) 对自制粗木聚糖进行了含量测定，确定了各种条件下制得的粗木聚糖的纯度。 4 ) 透明圈法初步测定各种实验菌的产酶酶活，结果表明球毛壳菌A C C C 3 0 5 6 6 、 米曲霉、血红毛壳( C h a e t o m i u m c r u e n t u m ) b o b 2 0 1 产生的透明圈较为明显。 5 ) 对木聚糖酶产酶时程进行研究，发现随着发酵时间的增加，底物木聚糖被降解， 木聚糖酶活性呈上升趋势。前2 5 d 酶活上升缓慢，2 5 d 后酶活急剧升高， 3 5 4 d 时达到最大值。 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 6 ) 氮源对产酶影响实验表明，不同氮源的培养基所产生的木聚糖酶酶活力顺序为： 蛋白胨 硝酸铵 氯化铵 硫酸铵 酵母膏，蛋白胨最有利于木聚糖酶的形 成。 7 ) 采用D N S 法研究了p H 值2 2 - 1 0 6 7 的范围内，不同p H 值对5 种毛壳菌木聚糖 酶活性的影响。结果表明，发酵3 5 d - 4 d ，p H 值为7 2 5 时木聚糖酶酶活力最 高，以蛋白胨为产酶培养基氮源时产酶效果最好。 8 ) 确定了低聚木糖的生产工艺，以自制的木聚糖酶分解玉米芯粗木聚糖，得到低 聚木糖，并进行了纯化和成分测定。 实验表明，贵州本地产玉米芯适合作为粗木聚糖的生产原料，本文所选菌种 的产酶效果较好，产生的木聚糖酶酶活力较高，适合低聚木糖生产，具有一定的 工业应用价值。 关键词：玉米芯毛壳菌木聚糖木聚糖酶低聚木糖 2 A BS T R A C T S i n c et l l e 缸l c ；t i o n a lo l i 9 0 s a c c 怵d e sh a v es o m ep h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，s u c h a s p r o m o t i l l gt h em u l t i p l i c a t i o no f B i f i d o b a c t e r i ai ni n t e s t i n e ，k e e p i n gag o o d h e a l t h Y f o r p e o p l e ，t h ef u n c t i o n a lo l i g o s a c c l l 矾d e sh a v e b e e na t t a c h e di m p o r t a n tt ob Y t h ep e o p l e A x v l 0 0 1 i g o s a c c h a r i d ei sa k i n do ff u n c t i o n a lo l i g o s a c c h a r i d e s ，唧o s e do f 2 - 7x y l o 争 e T h el i n kb e 咐e e nt h em o l e c u l e si s8 - 1 ，4 一x y l o s i d a t eb a n d I tc a n b ep r 印a r e db yp 。x y 1 a n a s er e a c t i o nw i n lC o m c o b ，c o t t o n ，s e e dh u l lo rr a p e s e e d h u l l I t sV c r yd 1 伍e u l tf o r x v l 0 0 1 i g o s a c c h a r i d e sd i g e s t i o ni ni n t e s t i n e s T h ei n t e s t i n a l 删i v o r s o fx y l o0 1 1 9 0 s a c c h ar i d e sa r et o om u c h ，a n dc a l lk e e pag o o dm u l t i p l i c a t i o nf o rB i f i d o b a c t e n a I h e u t i l i z a t i o no ft h ex y l o o l i g o s a c c h a r i d ei s t h eh i g h e s ta m o n gt h eo t h e ro l i g o s a c c h a n d e S Am a i z ei so n eo f 缸c em a i nf o o d s t u f fp l 觚t si n C h i n a T h ea v e r a g ey i e l do f t h ec o m c o b i sv e n ，b i g M o s to ft h ec o r n c o b sa r e b u r n t ，a l t h o u g haf e w a r eu s e d I t I sV e r yl m p o r t a l l t t od ot h er e s e a r c ha b o u tt h ex y l o o l i g o s a c c h a r i d e s p r e p a r a t i o nw l t hc o r n c o b s T h i st e X ta d o p tC h a e t o m i u mw h i c ha r en o ta p p e a ri nt h en e w s p a p 盯s a n dd l s h r e c o ，r di nc l l i n at op r o d u c ttx y l a n a s e ，o n t h eb a s i so fo p t i m i z i n gt h ep r e p a r a t l o n c o n d i t i o no fx y l a I l ， c o m b i n et r a n s p a r e n te n c l o s el a wa n dD N Sl a wd e t e n n l n eo t d i 鼢e n t 觚酗c sa c t i v i 哆t op r o d u c et h ee n z y m e T h i sp a p e rs t u d i e dt h e 雒e c t so f C u l 呲 t i m e ， c u l t I 】r et 锄p e r 籼e ，n i t r o g e ns o u r c c ， a n dp Ho nt h ea c t l V l t yo f x y l a n a s e m e x p e r i m e n t i s e x p l o r e d t h ef e r m e n t e d c o n d i t i o nf o r t h en e w f h n g u s P u r i f i e dt h ex y l a n a s e t op r o d u c ex y l 0 0 1 i g o s 疵h a r i d e T h e n p u r i f y t h e x V l o o l i g o s a c c h a r i d e ，T L C t oa n a l y s ec o m p o s i t i o no fd i f f e r e n tx y l o o l i g o s a c c m d e s f i n a l l y T h ec o n c r e t ec o n t e n ti sa sf o l l o w s ， 1 、s e l e c tf o ru s eC h 口e t o m i u mw h i c h a r en o ta p p e a ri nt h en e w s p a p e r s 锄d d l s hr e c o r d1 n c h i n a , A s p D D 嘲口a n dA s p e r g i l l u sc a n d i d u sL i n k a sp r o d u c ee l l z 舯e 咖g u s t 0 p r o d u c ee 1 1 Z 严e r e s u l tc o m p a r es e v e nf u n g u s F i n dA s p o r y z 口e t i n a I l y ，C h + c r ”e n 砌m b o b 2 0 1 a n dC h a e t o m i u m A C C C 3 0 5 6 6h a v eb e r t e rp r o d u c i n g t h e e n z y m er e s u l t ，s u i t a b l e f o ra sp r o d u c i n gt h ef u n g u st h a tt h ex y l a ng a t h e r e dt h e x y l a n a s e 2 ) w i ：hs i n 西ef a c t o ra n do n h 。g o n a le x p e r i m e n t a ld e s i 野m e r e s u l t ss h 。wt h a m e 3 o p t i m a lp r e p a r a t i o nc o n d i t i o no fx y l a ni s ：6 0 i ss o a k e df o ra nh o u r , r e f r i g e r a t e f o r8 - 10h o u r s ，2 3t h a te t h a n o lw a s h i n gc o n s u m p t i o ni sd o u b l e F i n dt h a ts o a k s t i m ea n de x e r t sal a r g e s ti n f l u e n c eo nr e s u l to ft h ee x p e r i m e n ti nt h ei n f l u e n c e f a c t o r , s e c o n d l yi t i st h et e m p e r a t u r eo fs o a k i n g ，r e f r i g e r a t et i m ea n de t h a n o l c o n s u m p t i o n 3 ) T h i sp a p e rs t u d i e dx y l a nc o n t e n td e t e r m i n e ，c o n f i r mt h ep u r i t yo ft h i c kx y l a nt h a t v a r i o u st e r m sm a k e ，h a v eo f f e r e db a s i so nw h i c ht h et h i c kx y l a np r e p a r e s c o n d i t i o n 4 ) T r a n s p a r e n te n c l o s el a wc o m b i n eD N S d e t e r m i n ev a r i o u sf u n g u st op r o d u c ee n z y m e a c t i v i t y E x p e r i m e n tf i n dA s p o r y z a ep r o d u c et r a n s p a r e n te n c l o s ec o m p a r a t i v e l y o b v i o u s ，C h c r u e n t u m b o b 2 0 1a n dC h a e t o m i u mA C C C 3 0 5 6 6e n z y m ev i g o re v e n r e l a t i v e l yh i g h 5 ) T h ee f f e c to fc u l t u r et i m eh a db e e ns t u d i e di nt h i sp a p e r , f i n dt h ei n c r e a s e w i t h f e r m e n t e dt i m e ，t h ex y l a ni sd e g r a d e d ，t h ea c t i v i t yo fx y l a n a s ei so nt h er i s e F o r m e r2 5 de n z y m ea c t i v i t yr i s es l o w l y , a n dt h e nr i s es h a r p l ya f t e r2 5 6 ，i tc a n r e a c ht h em a x i m u ma tt h e3 5 4 d 6 ) T h ee x p e r i m e n to fi n f l u e n c eo np r o d u c i n ge n z y m eo fn i t r o g e ns o u r c ef i n do u tt h a t ， t h eo r d e ro fx y l a n a s ep r o d u c t i o na c t i v i t yw h i c hh a so b t a i n e dd i f f e r e n tn i t r o g e n s o u r c e ：P e p t o n eo fa l b u m e n a m m o n i u mn i t r a t e A m m o n i u mC h l o r i d e a m m o n i u ms u l f a t e L o t i o no fy e a s t 7 ) T h ei n f l u e n c eo fx y l a n a s ea c t i v i t yw i t hd i f f e r e n tf u n g u sh a db e e ns t u t i e d ，i nt h er a n g e o f p H 2 2 1 0 6 7 b y D N S R e s u l ti n d i c a t eo p t i m a lf e r m e n t e dt i m e i s 3 5 d 4 d ，o p t i m a lp H i s7 2 5 ，a n dp e p t o n eo fa l b u m e ni st h eo p t i m a ln i t r o g e ns o u r c e 8 ) P u r i f i c a t i o nx y l o o l i g o s a c c h a r i d ew i t he v a p o r a t i o n c o n c e n t r a t e d ，d i a l y s e ，a l l l m o n i m u ms u l f a t eP r e c i p i t a t ei ng r a d e sm e t h o d K e y w o r d s ： c o r n c o b ， C h a e t o m i u m ，x y l a n ，x y l a n a s e ，x y l o o g o s a c c h a r i d e 4 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：鹎日期：一 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 师签名：奁过日期：2 Q Q 垦生互旦 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 1 研究背景 1 1 1 木聚糖 第一章绪论 木聚糖是自然界中的一种丰富的再生资源，是最具代表性的半纤维素，在植 物细胞壁中的含量仅次于纤维素，是拳纤维素中含量最丰富豹一种，约占半纤维 素的t 3 - 1 2 ，是除纤维素外，自然界中最丰富的多糖。它可以作为再生资源被微 生物转化为酶、单缨胞蛋龟、酒精等有用物覆，还可以诱导木聚糖酶的产生 ( H r m o v a ，M e ta l ，1 9 9 1 ) 。与纤维素相比，半纤维素更易被微生物降解转化，降解 产物木糖在酶的作篇下可转变为乙醇( W o o d ，W A 。，1 9 8 8 ) ，是谷物籽实中的主要 非淀粉多糖( N S P ) 之。它的存在使谷物中的营养物质不能被充分暴露于动物消化 液的表蓓，进而影响人体的消化吸收，降低了食物的营养价值，具有很强的抗营养 特性( 薛业敏等，2 0 0 2 ) 。在阔叶材和一年生禾本植物中木聚糖占植物原料干重的 2 潞一3 溉，针时材孛本聚糖含量较少，一般表原料干重7 一1 0 。 表1 - 1 为几种作物部分组织的主要成分( 李雄彪，1 9 9 1 ；邬义明，1 9 9 7 ) 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 表卜1 中国几种作物部分组织的主要组成成分 名称 纤维累禽斌、筘纤维綮含鬣本质蔡含壤水分禽撬 c e ll u L o s eh e m i c e ll u l o s e I i g n i n o is t u r e ( w w 薯) ( w w 篝) ( w w ) ( v w ) 玉米芯( 河北)3 5 4 l3 3 4 71 3 2 l量O 0 7 c o r n c o b ( H e b ei ) 玉米秸秆( 熬龙i ：D 4 0 。2 02 2 。3 0i 8 8 07 O O c o r ns t o v e r ( H eiL o n g jt a n g ) 稻壳 3 9 0 01 9 8 01 9 7 r i c eh u l l 稻孳( 辽宁) 2 7 4 82 1 6 7 l O 1 l 1 2 2 5 s t r a w ( L i a o n i n g ) 小麦麸瘦l I 6 0 2 9 9 8 5 3 21 1 0 0 w h e a tb r a n 小麦秸析( 河北) 4 0 4 02 5 5 62 2 3 4l O 。6 5 w h e a ts t o v e r ( H e b e i ) 棉籽壳 4 7 8 02 3 0 01 9 0 09 6 0 c o t t o n s e e dh u l1 甘蔗渣 耋2 。1 62 3 5 11 9 3 0 1 0 3 5 b a g a s s e 由表i - i 可以看出玉米芯中半纤维素含量最高，可达3 5 - 4 0 ( 余东霞等， 2 0 0 1 ) 。木聚糖的基本结构单元是由B 一1 ，4 一糖苷键连接的多聚木糖链，在D 一木糖 的第二位氧上连接有D 一葡萄糖醛酸或4 一o _ 甲基葡萄糖醛酸或在第三位氧上连接有 L 一阿拉伯呋喃糖。有些木聚糖还在第二或第三位氧上发生乙酰化。图1 - 1 为木聚糖 的化学结构。硬木中木聚糖为o _ 乙酰基一4 一沪甲基葡萄糖醛酸木聚糖，其木聚糖高 度乙酰化( 常发生在C - 3 的位置) 。这些乙酰基存在导致木聚糖在水中的部分溶解 性，当用碱提取木聚糖时，这些乙酰基可迅速被去除。软木中木聚糖由阿拉伯糖 苷一4 一o - 甲基葡萄糖醛酸木聚糖组成，与硬木中木聚糖相比，具有更高的4 一o - 甲基 葡萄糖醛酸含量。4 0 - 甲基葡萄糖醛酸残基连接在C - 2 的位置上，软木中木聚糖没 有乙酰化，在木糖的C - 3 位置上具有与Q - 1 ，3 一糖苷键相连接的Q - L - I ；u - j “ 拉伯呋喃 糖单位，几乎1 2 的木糖残基被阿拉伯糖取代。B - D - , t t , 南木糖、4 一o - 甲基一Q D - 葡萄糖醛酸和L 一阿拉伯呋喃糖的比例为1 0 0 ：2 0 ：1 3 。软木中木聚糖链比硬木中木 聚糖链更短些，多聚化( D P ) 程度在7 0 - 1 3 0 之间，其支链较少。常见的支链取 代基包括：O 一乙酰基、Q L 一呋喃阿拉伯糖基、a D - 喃葡萄糖醛酸基和4 一o _ 甲 基一a D 一吡喃葡萄糖醛酸基。后三种可以进一步通过酚残基如阿魏酸和香豆酸木 6 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 质素相连。一般阔叶材木聚糖以旷乙酰基一4 一O 一甲基一葡萄糖醛一木聚糖的形式存 在，而针叶材、禾本科植物中的木聚糖则主要以阿拉伯糖基一4 一。一甲基一葡萄糖醛 酸基木聚糖形式存在。支链取代基的化学组成及其出现的频率不但与木聚糖的植 物来源有关，还取决于木聚糖的分离提取方案。同时木聚糖以共价键与木质素相 连，以非共价键与纤维素相互作用，在维持原位纤维素的完整性和防止纤维免受 纤维素酶的降解方面起重要作用。木聚糖结构的差异主要表现为聚合度的不同、 取代程度不同( A r a X y l 比值反映) 、取代方式的不同以及阿魏酸含量的不同等等。 研究发现，水溶木聚糖和水不溶木聚糖的组成、结构基本相似，只是后者具 有较高的分支，且P A r a X y l 比值较高。水溶性木聚糖主要由阿拉伯糖、木糖、半乳 糖和葡萄糖组成，而水不溶戊聚糖主要由阿拉伯糖、木糖和葡萄糖组成。前者中含 有很高的半乳糖，为1 8 2 8 ，而后者中半乳糖的比例则很小。 4 - 9 一D - X p l m 4 一B D X p l - 4 - p D - X p l 一4 一p D x p l - 4 - p D - X p l - 4 - D - X p l - ttt L - a r a b i n o L a r a b i n o - D g l u c u r o n o 4 - O - m e t h y l g l u c u r o n o 1 3 - D - X p ：p D 吡喃木糖基 L a r a b i n o ：b 阿拉伯糖基 L a r a b i n o D g l u c u r o n o ：L 一阿拉伯糖基- D 一葡萄糖醛酸基 4 - O m e t h y l - g | u c u r o n o ：4 - O 一甲基- 葡萄糖醛酸基( 葡萄糖醛酸基) 图1 - 1 玉米芯木聚糖化学结构( 邬义明，1 9 9 7 ) F i g u r e l 一1C h e m i c a ls t r u c t u r eo fc o r n c o bx y l a n S 1 1 2 木聚糖酶 木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最关键的水解酶，可以水解植物材料中的半纤 维素，通过水解木糖分子间的B - 1 ，4 一糖苷键，将木聚糖水解为木寡糖和木二糖 等低木聚糖，及少量木糖和阿拉伯糖。因此可以破坏植物的细胞壁结构，提高内 源性消化酶的活性，提高食物养分的利用率；用木聚糖酶处理硫酸盐纸浆可减少 后续漂白处理化学剂的用量( V i k k a r i L e t a l ，1 9 8 6 ) 。饲料工业中添加木聚糖酶可 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 以为畜禽生产带来良好的生产效果和经济效益，同时在食品改良剂和酿酒等方面 也具有潜在应用价值( Y l k a m i ne t a l ，1 9 9 9 ) 。木聚糖酶分子只含一个亚基，分子 量在8 3 0k D 间的为碱性蛋白。分子量在3 0 - 1 4 5 k d 间的为酸性蛋白。P I 值为3 一1 0 5 ， 稳定p H 值为3 一1 0 。反应最适p H 值在4 - 7 之间，温度为4 0 - 6 0 。C u 抖、Z n 2 十、F e 2 + 和 F e 3 + 对酶有抑制作用，而C 0 2 + 和M n 2 + 能提高酶的活性( J a v i e r , D B e t 口，1 9 9 8 ) 。 细菌可以产生碱性和酸性酶，而真菌只可产生碱性酶。其中，丝状真菌分泌的胞 外酶最高。 木聚糖酶作为一种工业酶制剂，已在北美和欧洲大量使用，近几年来，木聚 糖酶在食品、纺织、饲料、能源、制浆造纸工业中显示了广阔的应用前景( W o n g ，K K e ta I ，1 9 8 8 ) 。应用木聚糖酶在纸浆生物漂白中，可减少环境污染；而作为饲 料添加剂，可消除“抗营养因子“ 戊聚糖，提高配合饲料的营养价值；还可以生 产出具有高附加值的功能性食品甜味剂低聚木糖。半纤维素在温和的条件下 很容易被稀酸水解，但纤维素则需要苛刻的条件。若酶解前对木质纤维素进行预处 理，那么半纤维素和纤维素再用酶水解会容易一些( W o o d ，W A e ta l ，1 9 8 8 ； O g a s a w a r a ，H e ta l ，1 9 9 1 ) 。此外，木聚糖酶还可以提高酒液的澄清度，具有分解 半纤维素产酒精的性能，提高酿酒过程中的淀粉酶活力从而提高酒精产率的作用 ( 周文美等，2 0 0 6 ) 。在酿酒方面的应用主要有： 1 酿酒过程中利用木聚糖酶提高淀粉酶活力，提高酒精产率 在酿酒行业中，作为原料的粮食的淀粉层外围有纤维素和木聚糖等半纤维素 的包围，从而影响到对淀粉的利用率。目前，对纤维素酶的利用研究较多，而半 纤维素酶的应用尚处于初级阶段( 胡学智等，2 0 0 5 ) 。利用木聚糖酶作用于半纤维 素层，降低物料粘度，有利于淀粉酶作用于淀粉层，提高淀粉利用率，增加酒精 的产率。目前，对于适合某类酒的酿造的木聚糖酶生产菌还缺少针对性的筛选， 产酶过程的优化及酶类的提纯方面也少有研究，故其应用成本较高，尚未工业化 应用于酒类酿造过程。 1 9 9 1 年，日本学者分离纯化了A k a w a c h i i 产生的木聚糖酶X y l C ，主要应用于 日本大麦烧酒生产中的，并研究出其最适作用条件为p H2 0 ，提高了发酵效率和 酒精的产率( O g a s a w a r a ，H e ta l ，1 9 9 1 ) 。 2 0 0 1 年，江南大学陆健等从米曲霉( A s p e r g i l l u s o r y z a eR I B l 2 8 ) 中分离纯化得 到了一耐酸性的木聚糖酶( 木聚糖酶B ) ，其分子量为6 5 k D a ，最适作用p H 为6 5 ，在 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 p H 2 0 时其酶活还保持稳定。将它应用于日本清酒的酿造中同样有助于提高发酵 效率和酒精产率( 陆健等，2 0 0 1 ) 。 2 木聚糖酶提高酒液澄清度 酒类浑浊的原因有生物浑浊和非生物浑浊，其中非生物浑浊包括蛋白质多酚 混浊、酒花树脂浑浊、糊精浑浊及非淀粉多糖浑浊等( 梅丛笑等，2 0 0 0 ) 。 白酒中含有的多种高级脂肪酸乙酯、高碳链的醇醛酸酯等均溶于乙醇，不溶 或难溶于水。在低度酒的生产中，当酒度降低时这些有机物溶解度减小，从而以 白色浑浊状态存在，小部分的难溶物质与不溶物一起析出，形成了极难澄清和过 滤的乳浊液( 张惠苓等，2 0 0 3 ) 。另外，随着温度的降低，各类香型白酒都会出现 失光、浑浊、产生絮状沉淀等现象。目前，白酒除浊主要用吸附过滤、膜分离等 手段，常用的吸附材料有活性炭、淀粉、分子筛、硅藻土、高岭土等。膜分离技 术包括微滤、超滤、电渗析、反渗透等。利用高分子膜截流浑浊物质可达到除浊 目的( 唐振球等，1 9 9 0 ) 。 啤酒生产原料中由于B 一葡聚糖和木聚糖含量较高，造成麦汁过滤困难，酒液 混浊，啤酒滤膜堵塞等问题。解决这些问题需要大量的资金和技术投入，这样就 增加了啤酒的生产成本。 而木聚糖酶可以和B 一葡聚糖酶协同作用，从而解决滤膜堵塞问题，可提高酒 液的澄清度，降低酿酒成本。对酒液的澄清，目前研究较多的是自然静置、过滤、 加悬浮澄清剂等物理过滤方法，添加絮凝澄清助剂等，并且在加入过程中用量或 时间控制不当会严重影响澄清效果，而且除了会影响酒体本身的稳定性外，还会 带来新的不稳定的因素和影响酒的质量：对于目前应用的多种过滤机还需经常更 换过滤材料，费时、费力，并且严重影响产品的质量和产量。而一些酶制剂的应 用，由于其活化前处理工艺复杂，成本偏高，澄清效果也未达到理想状态。木聚 糖酶应用于酒液澄清是一个有潜在应用价值的研究方向。目前，已有商品化木聚 糖酶应用于啤酒生产工艺中，以解决过滤困难和混浊问题。 3 木聚糖酶分解半纤维素产酒精 随着石化燃料的日趋紧张和环境污染的日益严重，开发利用清洁可再生能源 具有长远意义。其中研究开发燃料乙醇的生产备受关注。纤维素是地球上贮量最 丰富的有机物质。而每年用于工业过程或燃烧的纤维素仅占2 左右，还有很大一 部分未被利用，因此研究开发纤维素的转化技术，将秸秆、蔗渣、废纸、垃圾纤维 9 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 等纤维素类物质高效地转化为糖，进一步发酵生产燃料酒精，对开发新能源，保护 环境具有非常重要的现实意义。 木质纤维素是由纤维素丝嵌入到大分子的蛋白质、果胶、木质素和半纤维素 基质中所组成的。其中两种主要的碳水化合物：纤维素和半纤维素的千重分别占 4 5 和2 5 ( 常秀莲，2 0 0 1 ) 。纤维素是细胞壁的主要成分，在纤维素的周围充填着 半纤维素和木质素，阻碍了纤维素酶同纤维素分子的直接接触。通过化学和生物化 学的方法可将纤维素和半纤维素水解成单糖，继而发酵生产酒精。要提高纤维素物 质转化为乙醇的利用效率，半纤维素糖的利用十分重要。 半纤维素在温和的条件下很容易被稀酸水解，但纤维素则需要苛刻的条件。若 酶解前对木质纤维素进行预处理，那么半纤维素和纤维素再用酶水解会容易一些 ( 许凤等，2 0 0 1 ) 。预处理主要包括粉碎、溶解、水解和分离纤维素、半纤维素和 木质素的组分。这些方法包括浓酸、稀酸、碱、二氧化硫、过氧化氢、蒸汽爆破、 潮湿、氧化、石灰处理、热水处理等。研究表明，在酶解前用二氧化碳爆破的方 法对纤维物质进行预处理效果更好( 曾莹等，2 0 0 5 ；张宇昊等，2 0 0 4 ) 。 木质纤维的转化主要分两个步骤：木质纤维生物量中纤维素水解生成还原糖； 糖发酵成乙醇。基于目前的技术，木质纤维原料生产乙醇的主要问题是得率低、 水解成本高。促进木质纤维水解的方法包括：木质纤维原料预处理脱除木素和半 纤维素；纤维素酶的优化；同步糖化发酵法( S S F ) 。 2 0 0 1 年，烟台大学常秀莲等采用稀酸水解和酶水解将半纤维素和纤维素转化 为可发酵性糖，再采用基因工程细菌将木质纤维素中的糖转化成乙醇，用作燃料。 半纤维素衍生糖补充一定的营养成分，经过4 8 h 的发酵，乙醇浓度可达4 0 9 L ，为理 论产率的9 0 以上。 4 利用酒糟生产木聚糖酶 啤酒糟是啤酒酿造生产的主要废弃物之一，据测定鲜啤酒糟含水分6 9 ，粗 蛋白6 2 ，粗脂肪1 1 ，粗纤维3 4 ，无机氮浸出物1 0 4 。其中无机氮浸出物 的主要成分是木聚糖。近年来，我国啤酒工业得到迅速发展，年产啤酒超过2 0 0 0 多万吨，成为世界上第二大啤酒生产国，由此产生约1 0 0 0 万吨的啤酒糟。长期以 来，工厂主要是将湿酒糟作为粗饲料直接低价出售，其收益甚微，有少数厂家则 是将湿酒糟直接排放，这不仅造成严重的环境污染，还导致资源的浪费，为此， 一些研究人员对啤酒糟的利用进行了多方面的研究探讨，以啤酒糟为主要原料添 1 0 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 加其他辅料，利用通过选育得到的木聚糖酶生产菌，进行发酵生产木聚糖酶。 2 0 0 4 、2 0 0 5 年，湖北工业大学曾莹等研究筛选出了能发酵啤酒糟，高产木聚 糖酶的菌株一黑曲霉( A s p e r g i l l u sn i g e r ) 2 7 2 - 1 ，并对其产酶条件进行了优化。 结果表明，黑曲霉( A s p e r g i l l u sn i g e r ) 2 7 - 2 - 1 在啤酒糟：玉米芯：麸皮= 6 ：2 ：2 ， N H 。N 0 32 ，T w e e n 8 00 1 的基质上加水比为5 0 ，接种量为3 5 ，置3 0 。C 下培养 2 d 一3 d ，产酶量可达3 1 0 5 4 I U g 。这一研究具有较好的应用前景( 曾莹等，2 0 0 4 ) 。 白酒丢糟是白酒酿造后的废弃物，酸度大，水分含量在6 0 以上，不便储存、干 燥，并且干燥物中含有6 0 一6 5 难于消化的稻壳，利用价值较低，常作为粗饲料或 当作垃圾废弃，不仅污染环境且社会效益差。 2 0 0 1 年，齐齐哈尔大学关宏等对白酒糟的利用做了研究。木聚糖酶产生和黑 曲霉( A s p e r g i l l u sn i g e r ) 1 - 1 3 菌株以白酒丢糟作为碳源，进行固体发酵生产木聚糖 酶。采用单因素搜索对其最适产酶的氮源和发酵条件进行优化，结果表明：添加的 最适氮源为硫酸铵，最适加入量为l1 6 ( 以白酒糟干质量计) ；最适产酶发酵条件： 温度为3 0 ，初始含水量为5 5 ，接种量为l m L 菌悬液( 浓度为7X1 0 7 个m L ) 接种到 1 0 9 固体培养基中，在此优化条件下培养7 2h ，木聚糖酶活力可达最高为3 7 0 I U g ( 关宏等，2 0 0 1 ) 。 大多数微生物在自然条件下可同时产生多组分的纤维素酶和木聚糖酶等水解 酶( E s p i n o re ta l ，1 9 9 4 ) ，其中木聚糖酶主要是由内切一木聚糖酶( e n d o l ， 4 一D X y l a n a s e ，E C 3 2 1 ) 和1 3 一木糖苷酶( e x o - 1 ，4 1 3 一D X y l o s i d a s e ，E C 3 2 1 3 7 ) 组成。内切一木聚糖酶以内切方式水解木聚糖分子中的1 3 1 ，4 木糖苷键，其水解 产物为木二糖和木寡糖，也有少量木糖。1 3 一木糖苷酶以外切方式从非还原端水解 木二糖及木二糖以上的木寡糖，其水解产物为D 一木糖。一般而言，酶解时由内切 木聚糖酶从主链内部先作用于长链木聚糖的糖苷键上，将木聚糖随机地切成不同 链长的低聚木糖后，再由1 3 一木糖苷酶作用于木低聚糖的末端，将这些短链低聚 糖降解成木糖。通常，酶解的概念就是指得到最终产物单糖，没有选择性控 制酶解之说法。为了得到尽量多的酶解的中间产物低聚木糖，在采用生物酶法制 备低聚木糖时必须在酶解过程中采用各种控制方法以抑制木糖苷酶的水解作用， 应该使内切木聚糖酶活力高而1 3 一木糖苷酶活力低，这样才能得到大量木低聚糖， 少量的木单糖。低聚木糖的主要有效成分为木二糖和木三糖。低聚木糖的生产过 程包括木聚糖的提取和精制、木聚糖的水解和纯化几个步骤。目的为获得木二糖 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 和木三糖质量分数高的低聚木糖产品。根据木聚糖酶分子的结构区域的研究可知， 许多木聚糖酶还具有纤维素酶活性( T o m m e pe ta l ，1 9 9 5 ) 。因此，采用生物酶解技 术制备低聚木糖应得到一种较纯净的木聚糖酶制剂，其中内切木聚糖酶活力高， 不含1 3 一木糖苷酶，可有效提高木二糖含量，同时不具有纤维素酶活力，可免除现 有低聚木糖生产中从玉米芯中提取木聚糖并精制的过程。 为获得更多的低聚木糖，在研究酶解条件时，以酶解产物中所含的木低聚糖 的种类和相对含量为依据，采用控制加酶量、酶解时间及酶解温度等手段来控制 B 一木糖苷酶的水解作用。选择性控制酶水解可以采用控制水解条件，如控制酶用 量和酶解时间或者采用某种方法有效抑制t 3 一木糖苷酶活力或选择性纯化内切B 一 木聚糖酶。 1 1 3 低聚木糖 低聚木糖亦称木寡糖，由2 - 7 个D 一木糖以1 3 - 1 ，4 一木糖苷键结合而成，以木 二糖，木三糖为主。主要是以富含木聚糖的植物资源，如木屑、玉米芯、棉籽壳 稻壳和菜籽壳等为原料，经内切型木聚糖酶水解后，再进行分离、精制而制得。 低聚木糖极难被消化吸收，肠道内残存率高，具有显著的双歧杆菌增殖性，不被 消化性，无龋齿性以及促进人体对钙的吸收等特性，其选择利用性高于其它功能 性低聚糖。因此低聚木糖作为一种新型功能性低聚糖已成为食品工业研究开发的 热点之( 陈瑞娟，1 9 9 3 ；郑建仙，1 9 9 9 ) 。我国是一个农业大国，每年都产生大 量的玉米芯、甘蔗渣、秸秆和稻草等农林废弃物，其含有丰富的木聚糖类半纤维 素。 近年来，人们对低聚糖的生产与应用的研究越来越多，已有多种低聚糖投人 了工业生产并应用于保健食品中，低聚木糖是其中的一种。低聚木糖在日本的产 量已达到4 t 。与其它低聚糖相比低聚木糖具有达到显著双歧杆菌增殖效果、用量 小、耐酸、耐热、降低水分活度和防止冻结等特点。低聚木糖除用作食品功能因 子外，还可作为保湿剂或低热量添加剂在食品中使用。低木聚糖具有广泛的应用 价值，适合应用在功能性保健食品等方面，是主要的功能性低聚糖。首先低聚木 糖能改善动物肠道内的微生物菌群等特性。降解可溶性多糖，降低其粘性；减少 胃肠道疾病，增进人体健康。低聚木糖难以被胃消化而能进入肠道，低甜度，低 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 热量，难被人体消化吸收( 张守文等，2 0 0 6 ) ，但可被发酵，基本上不增加血糖血 脂。可在低能量食品中发挥作用，最大限度地满足那些喜欢甜品又担心发胖者的 要求，还可供糖尿病人、肥胖病人和高血糖病人食用( 石波等，2 0 0 1 ；N e e t a K u l k a r n 甜a l ，1 9 9 9 ；P e n b r o k e ，J T e ta l ，1 9 9 2 ) 。增加维生素含量，提高机体免疫能力。 低聚木糖还可以防龋齿，促进人体钙、铁的吸收( 杨本宏等，2 0 0 0 ) 。降低血清 胆固醇和预防结肠癌等，可广泛用于食品、饮料、医药、保健行业( 胡学智，1 9 9 7 ) ， 还可部分替代抗生素。而且它与通常为高分子的膳食纤维不同，它属于小分子物 质，添加到食品中基本不会改变食品原有的组织结构及物化性质。图1 - 2 为其主 要成分木二糖和木三糖。与其他低聚糖相比，低聚木糖的另一突出特点是稳定性 好。5 的低聚木糖水溶液在p H 2 5 - 8 0 的范围内，煮沸1 h 无变化。1 低聚木 糖的水溶液在p H 2 5 - 7 0 范围内，分别于5 “ C 、2 0 、3 7 “ C 温度下贮存3 个月， 没有发生明显的变化。p H 3 4 左右的饮料在室温下贮藏1 年，其中低聚木糖的保 留量达到9 7 以上。这说明低聚木糖能在食品中得到广泛的应用，因为p H 2 5 - 8 0 几乎覆盖所有的食品体系。 低聚木糖不但稳定性好，而且还具有降低水分活度的作用，其对水分活度的 影响与葡萄糖相近，但高于木糖低于麦芽糖和蔗糖。低聚木糖具有改善大便的功 能，摄人低聚木糖后增加了大便中的水分，这样可改变大便的形态，从而防止便 秘的出现。 除此以外还具有显著的双歧杆菌增值能力( O k a z a k i ，M e ta l ，1 9 9 0 ) ，且肠道 菌对其利用率较差。人体肠道菌对人体的健康具有重大的影响，当人体处于健康 状态时，有益菌占优势，其中双岐杆菌为优势菌之一。该菌对维持人体健康的作 用具体表现为：产生有机酸( 如乳酸、醋酸等) 使肠道p H 值下降，抑制病原菌的生 长；抑制腐败细菌的发育，使肠内腐败物质减少；合成人体发育所需的营养物质， 如：B 族维生素，维生素K 等；参与代谢，促进肠道蠕动，防止便秘；促进人体对 营养物质的消化吸收，如：它分泌的1 3 一半乳糖苷酶可增加对乳糖的吸收，改善乳 糖制品中乳糖的消化特性，使一些