荧光效率仪使用方法.ppt

Handy-PEA 和 BiolyzerHP3 使用方法,崔国瑞,一、快速叶绿素荧光诱导动力学曲线,1. 简介 将暗适应的绿色植物或含有叶绿素的 部分组织突然暴露在可见光下之后就会观察到，植物绿色组织发出一种暗红色，强度不断变化的荧光，荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。,O点 J点 I点 P点,植物发出的荧光强度随时间而变化，在从暗适应到暴露在光下时，荧光强度先上升然后下降。一般情况下，刚暴露在光下时的最低荧光定义为O点，荧光的最高峰定义为P点，快速叶绿素荧光诱导动力学曲线指的就是从O点到P点的荧光变化过程，主要反映了PSII的原初光化学反应及光合结构的结构和状态等的变化，而下降的,阶段主要反映了光合碳代谢的变化，随着光合碳代谢速率的上升，荧光强度逐渐下降（Krause和Weis，1991）。 连续激发式荧光仪（如Handy-PEA ）主要是通过短时间照光后荧光信号的瞬时变化反映暗反应活化前PSII的光化学变化，它具有相当高的分辨率 ，所以能够从O-P上升过程中捕捉到更多的荧光变化信,息，如O-P变化过程中的另外两个拐点（J点和I点）。从照光后的10 s到5 min内不同时间的荧光信号都能被按时记录。在对快速叶绿素荧光诱导动力学曲线作图时，为了更好地观察J点和I点，结果得到O-J-I-P诱导曲线。 植物快速叶绿素荧光诱导曲线中包含着大量关于PSII反应中心原初光化学反应,的信息（Force et al，2003；Lazr，2006），通过对曲线荧光参数的分析，可以知道植物不同发育时期光合结构的变化。 为了能更好地反映动力学曲线和被测样品材料的关系，Strasser和Strasser（1995）以生物膜能量流动为基础，通过计算能量流和能量比率来衡量在给定物流状态下样品材料内部变化，建立了高度简,化的能量流动模型图。依照能量流动模型，天线色素（Chl）吸收的能量（ABS）的一部分以热能和荧光（F）的形式耗散掉，另一部分则被反应中心（RC，在JIP-test中RC指有活性的反应中心）所捕获（TR），在反应中心激发能被转化为还原能，将QA还原成QA-，后者又可以被重新氧化，从而产生电子传递（ET），把传递,的电子用于固定CO2或其它途径。在此基础上发展起来的数据处理称为“JIP-test”。JIP-test为我们提供了被测样品材料的大量信息。快速叶绿素荧光诱导动力学曲线包含丰富和复杂的信息。,二、Handy-PEA使用说明,1. 确定HPEA主机电量充足并且连接好探头。 2. 从菜单中选择协议(Protocol )选项（屏幕ID#12）。应该有5个空的协议位置和1个默认的协议位置，按OK键，选择默认协议。 3. 按上下键，选择时间设定项(Duration setting)，按OK键确认。键入所需的时间（选择范围：1300秒），按OK键结束。用同样的方法设定光源的强度为3000mol.m-2.s-1。,4. 用配备的暗适应夹，对叶片进行充分的暗适应。将叶片夹入暗适应夹中，关闭适应夹上的金属遮光片，暗适应10分钟以上。,5. 将探头置于暗适应夹上的圆形槽之中，确保探头与暗适应夹紧密接触，无光线进入。用手按紧探头与暗适应夹，拉开适应夹上的金属遮光片。,6. 按下探头一侧的遥控按钮，或从菜单中选择测定功能进行测定。 7. 待仪器测定完毕后（大约1秒），记录测定数据的编号，然后点击OK。使用上下光标选择是否保存数据，数据保存完毕点击OK即可进入下一次测定。,三、数据传输与保存,1. 将仪器与计算机连接，点击on/off打开仪器。 2. 双击打开数据传输软件,出现下图,点击图片进入,从HPEA中传出数据,如果要输入的数据是第100-200个，应在First file中输入100，在Last file中输入200，然后点击Transfer。,传输完毕，点击“Close”,保存数据,保存文件，自定义文件名,点击OK，完成数据保存。,在对话框中输入描述数据的字符，字符不超过250个即可。,如何打开保存文件？打开传输软件，点击,在文件夹中找到目标文件，打开即可,点击OK，即可打开文件查看数据。,四、BiolyzerHP3 使用说明,双击打开 BiolyzerHP3 分析软件,点击close,点击图片,点击,选择文件,注意，此处可能出现错误！ 正确如下，可点击“是”,错误如下，出现原因是：测定数据存在异常数值，在传输软件HPEA中将异常数值删除即可。,用HPEA传输软件打开出现错误的文件，选中异常数值，右键点击Cut selected lines即可，然后再次保存数据。,打开文件后，点击下图中的“大脑”图标,工具栏功能增加，变为,选中待处理的数据,如果要保存数据，点击“Tools”,出现下图,点击上图中的红圈处的下拉箭头，选择“MS-Excel File”,点击“YES”,选择路径，保存文件。用Excel可打开文件,如果想进一步看数据之间的差异，选择不同的模式处理你的数据，具体可供选择的有如下红色圆圈中的模式：,点击红圈中的按钮可看到O-J-I-P图,利用右上角“Plot settings”可设定一些参数。,如：X和Y轴范围,点击红圈中的图标,可以做出下图,并得到大量数据,五、应用实例,李鹏民, 高辉远, Reto J. Strasser (2005). 快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用. 植物生理学与分子生物学学报, 31 (6): 559-566 (重点参阅此文) 许珍, 李鹏民, 高辉远, 董树亭, 王空军, 张吉旺(2007). 玉米不同朝向叶片原初光化学反应日变化的差异. 作物学报, 33(8): 1375-1379 孙山, 王少敏, 王家喜, 高辉远(2008). 黑暗中脱水对金太阳杏离体叶片和功能的影响. 园艺学报, 35(1): 1-6 以上是一些中文应用实例，可用于入门学习。更多应用实例可根据需要自行查阅。,结 语,以上是对荧光效率仪的简单介绍，还有很多功能有待大家在使用过程中去开发和利用。 由于它具有获得信息量大、操作简便、易于重复等特点，所以是深入研究光合作用原初反应的一种有力而便捷的工具。,参考文献,Force L, Critchley C, van Rensen JJS. 2003. New fluorescence parameters for monitoring photosynthesis in plants. Photosynth Res, 78: 1733 Krause GH, Weis E. 1991. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: the basics. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 42: 313349 Lazr D. 2006. The polyphasic chlorophyll a fluorescence rise measured under high intensity of exciting light. Functional Plant Biology, 33: 930 Strasser BJ, Strasser RJ. 1995. Measuring fast fluorescence transient