植物组织培养的一般技术.ppt

第二章,植物组织培养的一般技术,植物组织培养的一般技术,操作技术 培养基的成分及作用 培养基的种类与选择 培养基的配制方法,操作技术,洗涤 灭菌 无菌操作 培养容器封口物的种类及制作,灭菌,有菌的范畴：凡是暴露在（未经处理的）空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体，至少它的表面，毫无例外都是有菌的。它的内部在未经证实之前，也应该作为有菌物体来看待。 无菌的范畴：经过高温灼烧或蒸煮过后的物体，经其他物理或者化学灭菌方法处理过后的物体，是无菌的。高层大气、岩石的内部，健康的动物和植物不与内外部表面接触的组织内部很可能是无菌的。强酸强碱、化学灭菌剂等表面和内部是无菌的。,无菌的世界远远小于有菌的世界！,灭菌,培养基的灭菌 不耐热的物质将采用过滤灭菌 玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 布制品采用高压灭菌 其他 植物材料的表面灭菌,培养基的成分及作用,在完善的培养基配方中至少应包括下述几个部分： 大量元素 微量元素 铁盐 有机成分 琼脂 糖 植物激素 PH 其它成分,大量元素,植物所需要的元素，其浓度大于0.5毫摩尔/升应该属于大量元素 大量元素包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等九种元素，他们占植物干重的百分之几十到万分之几 生理作用：1）参与肌体构造；2）构成一些特殊的生理活性物质；3）电化学方面的作用:维持离子浓度平衡，胶体稳定，电荷平衡；4）发育方面起的作用：影响植物组织形态发生、器官形成。,微量元素,植物所需要的元素，其浓度小于0.5毫摩尔/升应该属于微量元素。 微量元素包括Fe、Cu、Mo、Zn、Na、Mn、Co B和I等，通常培养基中添加10-710-5就可满足需要 生理作用：酶的催化、细胞分化和维持细胞完整机能等方面,多年的研究结果： Cu有促进离体根生长的作用； Mo是合成活跃硝酸还原酶所必不可少的元素，也是固氮酶的组成部分，还有防止叶绿素受破坏的作用； Mg、Zn、Na是酶的组成成份，也有防止叶绿素破坏的作用； Mn与植物的呼吸作用和光合作用有关； B与糖的运输、蛋白质的合成有关。,当缺乏某种元素时，往往会表现一些缺素症： 缺N：某些组织呈现鲜艳的花色素苷的色彩，导管不能形成； 缺N、P、K：细胞变得肥肿而形成层组织减少； 缺S：产生非常明显的黄萎病；缺Fe：细胞分裂停止； 缺B：细胞分裂和细胞生长延缓； 缺Mn或Mo：生长受影响。,铁盐,采用硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠结合成螯合铁配置而成 作用：促进细胞的分裂与生长；影响叶绿体的结构组成与叶绿素的形成。,有机成分,维生素类：植物组织培养中经常使用维C、维B1（盐酸硫胺素）、维B6（盐酸吡哆素）、维H（生物素）、叶酸和烟酸等，一般使用的浓度为0.110mg/l 肌醇：本身没有促进生长的作用，但有助于活性物质的发挥，并参与糖代谢，能使培养组织快速生长，对胚状体和芽的形成有良好的影响 氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白、水解乳蛋白 有机添加物：椰乳、香蕉等,琼脂,一种从海藻中提取出来的凝固剂，一般使用浓度为0.6%1%。以前使用琼脂条，现在使用琼脂粉，以色白、洁净的为好。,糖,糖的作用：a.作为C源，为细胞提供合成新化合物的碳骨架；b.为细胞的呼吸代谢提供底物与能源；c.维持一定的渗透势。 使用最广泛的是蔗糖和葡萄糖，一般的使用浓度为2%4%。 一般来说，以蔗糖做糖原时，离体的双子叶植物的根生长得最好，而以葡萄糖为C源时，单子叶植物的根生长得最好。 为了节省成本，一般选用食用白糖。,植物激素,生长素类 细胞分裂素类 其它植物激素 赤霉素（GA3） 脱落酸（ABA） 多效唑（PP333）,生长素类,主要作用：诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽和不定芽的产生。 常用的生长素类物质：2，4D（2，4二氯苯氧乙酸）、NAA（奈乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）。 它们作用强弱顺序：2，4D NAAIBAIAA,细胞分裂素类,主要作用：促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其它的激素作用。 常用的细胞分裂素类有：KT(激动素)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、ZT（玉米素）、2iP（2异戊烯腺嘌呤）、4PU、CPPU（吡效隆）和TDZ（噻重氮苯基脲）。 作用的强弱顺序：TDZ, 4PU ZT 2iP 6-BA KT。,PH,培养基的PH值，直接影响离子的吸收，过酸过碱对材料的生长都不利。 对大多数植物来说，灭菌之前培养基的PH调到5.66.0能达到要求。主要用KOH和HCl来调节。 一般来说，当PH值高于6时，培养基会变硬，低于5时琼脂不能很好的凝固。,其它成分,活性碳 硝酸银 香蕉泥、椰乳 抗生素类物质,培养基的种类与选择,培养基的种类 培养基的选择 培养基选择 常用的试验方法,培养基的种类,第一类为含盐量高的基本培养基，如MS、LS、BL、ER。 第二类为硝酸钾含量高的基本培养基，如B5、N6、SH。 第三类是无机盐中等含量培养基，如H基本培养基和Nitsch基本培养基。 第四类为低盐含量基本培养基，如White、WS和HE基本培养基。,培养基选择,1、基本培养基的选择 （1）在选择一种新的植物材料进行组织培养时，为了尽快建立起再生体系，最好选择常用的一些培养基 ，如MS培养基； （2）如果MS培养基不理想，可首先降低它的浓度； （3）其次再选择在配料成分上与MS有显著不同的其它培养基加以试用对比 。,培养基的选择,2、激素浓度和相对比例的确定 在试验中，首先应参考已有的报道，看是否有用相同的植物、相同的组织或相近者做过成功或失败的试验，如果有则可直接作参考；如果没有，则在建立激素配比中，将每一种拟使用的激素选择35个水平，再按随机组合的方式建立起如下的实验方案。,16种激素配比实验方案,常用的试验方法,1、预备实验 2、单因子实验 3、多因子实验及正交设计 4、广谱实验法 5、逐步添加和逐步排除的实验方法,培养基的配制方法,培养基成分的浓度换算 体积百分比浓度 重量百分比浓度 摩尔浓度 培养基母液的配制 大量元素母液的配制 微量元素母液的配制 铁盐母液配制 植物生长调节物质及其他有机物质母液的配制,培养基配制程序,过滤灭菌装置,总结,通过本章内容的学习 掌握组织培养的一般操作技术 理解培养基的成分及作用 了解培养基的种类与选择,无菌操作,大量元素母液的配制,大量元素母液浓度一般为原培养基浓度的10、20或50倍，有时也可用l00倍，倍数不宜过高，也不宜过低。 有时将CaCl2 2H2O单独配制保存，以免长期贮存发生沉淀。 将全部大量元素配在一起时，为防止在混合时发生沉淀，须在各药品充分溶解后，按表中顺序混合，氯化钙最后加入，以免与硫酸镁形成沉淀。 称量大量元素的化合物用感量为0.01克的扭力天平即可。,微量元素母液的配制,微量元素母液浓度宜为原培养基配方中用量的100倍。 一般将微量元素分别称量溶解，贮存在一个瓶个，但也有将KI分别配制，单独贮存在棕色瓶中。 称量微量元素化合物宜用感量为0.0001g的电子分析天平。,铁盐母液配制,培养基中的铁盐母液一般单独配制 目前常用的铁盐为硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物 配制时，用感量为0.01g的扭力天平称取,植物生长调节物质母液的配制,植物生长调节物质如生长素类(IAA，NAA)和细胞分裂素类(KT，BA)，可根据需要，灵活设计其浓度，一般为0.01，0.1、0.2、0.5和2mg/L。一般用感量为0.0001g的电子分析天平称量。IAA要用棕色瓶，暗中贮存，以免光照分解。,其他有机物质母液的配制,椰乳：采集到椰子时应检查其汁液(保证没变质)，首先将椰乳混合，用纱布或滤纸过滤去渣。将滤液放入80水