快速检测珠蛋白基因突变的荧光定量PCR技术的建立及应用.doc

快速检测-珠蛋白基因突变的荧光定量PCR技术的建立及应用周代锋 【摘要】： 本研究旨在建立快速检测中国人群中6种最常见的-珠蛋白基因突变类型的荧光定量PCR技术,并将该技术应用于-地中海贫血(简称-地贫)的基因诊断和产前基因诊断。 首先在等位基因特异性PCR的基础上,应用SYBR green I荧光染料建立了针对中国人中6种最常见-珠蛋白基因突变类型,即CD41-42(-CTTT)缺失突变、TATA盒nt-28(AG)突变、IVSII654(CT)突变、CD71-72(+A)移码突变、CD17(AT)无义突变和CD26(GA)突变的荧光定量PCR检测方法。用建立的荧光定量PCR技术检测了上述6种最常见-珠蛋白基因突变类型的阳性样本DNA,其基因分型结果与DNA测序结果完全相符,基因分型结果的特异性和准确率为100%。 应用上述建立的6种-珠蛋白基因突变类型的荧光定量PCR,成功地对20个-地贫家系共68例研究对象进行了基因诊断和产前基因诊断,在66例-地贫患者和携带者中,共有64例检测出了包含在上述6种-珠蛋白基因突变范围内的突变,检出率达97%,共检出13种-珠蛋白基因突变类型,其中CD41-42/N 25例,占37.88%,CD41-42突变纯合子8例,占12.12%,nt-28/N和IVSII654/N各7例,各占10.61%, CD41-42/ IVSII654双重杂合子5例,占7.58%,CD41-42/ nt-28双重杂合子3例,占4.55%,CD71-72/N和CD41-42/ CD71-72双重杂合子各2例,各占3.03%,CD17/N、CD26/N、CD41-42/ CD17双重杂合子、nt-28/ IVSII654双重杂合子和CD71-72/CD26双重杂合子各1例,各占1.52%,未知突变2例,占3.03%。研究结果表明,本研究建立的针对中国人中6种最常见-珠蛋白基因突变类型的荧光定量PCR检测方法,具有特异性高、成本低、快速简便的特点,适合于对大规模人群进行-地贫基因突变的筛查,将为高效、快速、准确地开展-地贫的基因诊断和产前基因诊断,搞好-地贫的防治工作提供一个技术平台。 应用上述建立的6种-珠蛋白基因突变类型的荧光定量PCR分析了1872例海南汉族人和2248例海南黎族人中6种最常见-珠蛋白基因突变类型的基因型和基因频率分布特点。研究结果表明,海南汉、黎族人群均是-地贫的高发群体。在海南汉族人中-地贫的携带率为2.08%,等位基因频率为0.0104,基因突变类型以CD41-42(-CTTT)缺失突变最多见,其次是TATA盒nt-28(AG)突变、IVSII654(CT)突变和CD71-72(+A)移码突变,突变类型较复杂、异质性较高;而在海南黎族人中-地贫的携带率为8.10%,等位基因频率为0.0405,基因突变类型比较单一,几乎全是CD41-42(-CTTT)缺失突变,未发现其它5种-地贫突变类型。以上研究结果初步提供了海南汉、黎族人-地贫基因突变的基因型和基因频率分布特点,为在海南省汉、黎族人群中开展地贫的防治工作提供了科学依据;此外,为研究我国群体遗传学、人类学、民族源流和变迁提供了分子遗传学依据。【关键词】：-珠蛋白基因 珠蛋白生成障碍性 荧光定量 PCR基因分析 海南省 【学位授予单位】：华南热带农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2007【分类号】：R450【DOI】：CNKI:CDMD:2.2007.146806【目录】： 摘要3-5 Abstract5-9 1 前言9-24 1.1 -地中海贫血的研究进展9-19 1.1.1 血红蛋白基因（Hb gene）9-10 1.1.2 -地中海贫血的形成及其分子基础10-12 1.1.3 -地中海贫血基因型与表型的关系12-15 1.1.4 -地中海贫血基因频率及分布15-16 1.1.5 -地中海贫血基因诊断16-19 1.2 实时荧光定量PCR 的研究进展19-23 1.2.1 实时荧光定量PCR 的原理19 1.2.2 实时荧光定量PCR 的荧光化学19-21 1.2.3 实时荧光定量PCR 的特点21 1.2.4 实时荧光定量PCR 的定量方法21-22 1.2.5 实时荧光定量 PCR 技术的应用22-23 1.3 本研究的目的和意义23-24 1.4 技术路线24 2. 材料与方法24-37 2.1 材料24-26 2.1.1 主要实验仪器24-25 2.1.2 主要实验试剂25 2.1.3 研究对象25-26 2.2 实验分析方法26-37 2.2.1 血液标本的采集及处理26 2.2.2 基因组DNA 提取26 2.2.3 建立检测中国人群中6种最常见-地贫基因突变类型的实时荧光定量PCR26-36 2.2.4 分析海南汉、黎族人群中6 种最常见-地中海贫血的基因突变类型、携带率和分布特点36 2.2.5 应用实时荧光定量 PCR 对海南省重型-地中海贫血患者进行基因诊断和产前基因诊断36-37 3. 结果与分析37-70 3.1 -珠蛋白基因DNA 片段的扩增和测序37-38 3.2 用实时荧光定量 PCR 进行中国人群中6 种最常见-地贫基因突变类型检测的基因分型结果及DNA测序验证结果38-62 3.2.1 CD41-42（-CTTT）缺失突变位点实时荧光定量 PCR 的基因分型结果及测序验证结果38-42 3.2.2 TATA 盒nt-28（AG）突变位点实时荧光定量 PCR 的基因分型结果及测序验证结果42-46 3.2.3 IV511654（CT）突变位点实时荧光定量PCR 的基因分型结果及DNA 测序验证结果46-50 3.2.4 CD71-72（+A）移码突变位点实时荧光定量PCR 的基因分型结果及DNA 测序验证结果50-54 3.2.5 CD17（AT）无义突变位点实时荧光定量 PCR 的基因分型结果及 DNA 测序验证结果54-58 3.2.6 CD26（GA）突变位点实时荧光定量 PCR 的基因分型结果及DNA 测序验证结果58-62 3.3 海南汉、黎族人群中6 种最常见-地中海贫血的基因突变类型、携带率和等位基因频率的分布特点62 3.3.1 海南汉族人群中6 种最常见-地中海贫血的基因突变类型、携带率和等位基因频率的分布特点62 3.3.2 海南黎族人群中6 种最常见-地中海贫血的基因突变类型、携带率和等位基因频率的分布特点62 3.4 应用实时荧光定量 PCR 对海南省重型-地中海贫血患者进行基因诊断和产前基因诊断62-70 4. 讨论70-74 4.1 检测中国人群中6 种最常见-地中海贫血基因突变类型的实时荧光定量 PCR 方法的建立70-71 4.2 海南汉、黎族人群中6 种最常见-地中海贫血的基因突变类型和携带率的分布特点71-73 4.3 应用实时荧光定量PCR 对海南省20 个-地中海贫血家系进行基因诊断和产前基因诊断73-74 5 结论74-76 参考文献76-86 英文缩略词表86-88 附录 攻读硕士研究生期间主持、参加的科研课题和发表的科研论文88-90 致谢90 推荐 CAJ下载 不支持迅雷等加速下载工具，请取消加速工具后下载 CAJViewer7.0阅读器支持所有CNKI文件格式，AdobeReader仅支持PDF格式 给遗传投稿 给中国医学文摘(儿科学)投稿 买房.卖房.租房.看房，全国各地小区房价对比 【参考文献】1朱旭,雷一鸣;我国及广西地中海贫血基因缺陷状态的研究状况J;医学文选;2005年04期2周代锋,蔡望伟,王政,王小英;海南省汉族人群中6种-地中海贫血基因突变的研究J;海南医学院学报;2005年05期3邓捷,庄广伦,彭文林,周灿权,梁晓燕,詹前胜,孙宏钰,陈勇,曾艳红;应用荧光PCR技术检测单细胞地中海贫血基因J;中山大学学报(医学科学版);2004年02期4汪洋,宫琳琳,邵淑娟;实时荧光定量PCR在肿瘤研究中的应用J;肿瘤;2004年02期5张蓓;实时荧光定量PCR的研究进展及其应用J;国外医学.临床生物化学与检验学分册;2003年06期6于国龙;实时荧光定量PCR在医学遗传学方面的应用J;国外医学.遗传学分册;2003年03期7李晓红,庄广伦,周灿权,程钢,舒益民,曾瑞萍;荧光定量聚合酶链式反应种植前胚胎-地中海贫血基因诊断J;中国生育健康杂志;2003年04期8邓少丽,罗阳;荧光定量PCR技术及其在临床上的应用J;国外医学.临床生物化学与检验学分册;2002年05期9区采莹,蒙晶,杨健,陈晓丹;海南地区-地中海贫血基因突变类型的研究J;中国优生与遗传杂志;2002年06期10王小红;荧光定量PCR技术研究进展J;国外医学.分子生物学分册;2001年01期【二级参考文献】1周代锋,蔡望伟,王政,蔡兰洁,王小英;海南省黎族人群中-地中海贫血CD26(GA)突变的研究J;海南医学院学报;2004年05期2焦泽旭,庄广伦,周灿权,舒益民,梁晓燕,李洁,张敏芳,邓明芬;对-地中海贫血携带者进行胚胎植入前遗传学诊断J;中华医学杂志;2003年04期3周代锋,蔡望伟,王政,陈倩,王小英;用等位基因特异性PCR筛查海南省黎族人-地中海贫血IVSII654(CT)突变J;海南医学院学报;2003年03期4李晓红,庄广伦,周灿权,程钢,舒益民,曾瑞萍;-地中海贫血种植前基因诊断妊娠成功J;中山医科大学学报;2002年04期5周代锋!海南医学院生化教研室!海口570102,蔡望伟!海南医学院生化教研室!海口570102,蔡兰洁!海南医学院生化教研室!海口570102,邝宇!海南医学院生化教研室!海口570102,周玉英!海南医学院生化教研室!海口570102;海南省黎族人4种地中海贫血基因突变的研究J;海南医学院学报;2001年01期6黄有文,张新华,王荣新,蔡利群,吴志奎,姜葆华,李承军;补肾生血治疗珠蛋白生成障碍性贫血进一步临床研究和免疫功能测定J;临床血液学杂志;2000年02期7黄有文,王荣新,蔡利群,张新华,朱凌;血红蛋白ConstantSpring(HbCS)的临床研究J;中国小儿血液;2000年03期8徐葵,曾瑞萍;对142例地中海贫血基因携带者进行缺失型地中海贫血1基因分析J;中华血液学杂志;1999年04期9潘红飞!533000广西百色,李强!533000广西百色,赵国章,农世光;广西西林县2423份新生儿脐血重型0地中海贫血的检测J;中华血液学杂志;1999年10期10李卫,高枫,林伟雄,苏承武;广西地中海贫血基因突变类型SSCP分析J;广西医科大学学报;1999年03期【相似文献】1柴立民,吴志奎;珠蛋白生成障碍性贫血药物治疗研究进展J;实用儿科临床杂志;2004年11期2韦启泽,刘德培,陶吉中,刘庆辉,贾佩臣,雷学锋,陈松森,梁植权;红系增强子的不同片段对转移的-珠蛋白基因在MEL细胞中表达的作用J;自然科学进展;1997年01期3杨林稚,王申五;-地中海贫血珠蛋白基因的分子克隆J;中国医学科学院学报;1986年S2期4鞠文东,黄峻,何维熊,胡钟旭,黄道连;兄妹二人同患尼曼-皮克病伴珠蛋白生成障碍性贫血J;新医学;2002年03期5陈士友,蒋俶,钱若兰;人体-珠蛋白基因5旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的相互作用J;实验生物学报;1996年04期6周代锋,蔡望伟,王政,蔡兰洁,王小英;海南省黎族人群中-地中海贫血CD26(GA)突变的研究J;海南医学院学报;2004年05期7陈卫东,李建新,房家智;轻型-地中海贫血的-珠蛋白基因突变检测J;现代检验医学杂志;2005年05期8刘元力;胡朝晖;曾征宇;郑建树;朱庆义;地中海贫血一个特殊基因突变的家系分析J;中国医药导报;2008年05期9纪新军,刘德培;-珠蛋白基因簇表达调控的反式作用因子J;国外医学.分子生物学分册;1996年06期10刘志杰,李西平;丁酸类化合物诱导珠蛋白基因表达的研究J;国外医学.儿科学分册;2001年05期快速检测-珠蛋白基因突变的荧光定量PCR技术的建立及应用周代锋 【摘要】： 本研究旨在建立快速检测中国人群中6种最常见的-珠蛋白基因突变类型的荧光定量PCR技术,并将该技术应用于-地中海贫血(简称-地贫)的基因诊断和产前基因诊断。 首先在等位基因特异性PCR的基础上,应用SYBR green I荧光染料建立了针对中国人中6种最常见-珠蛋白基因突变类型,即CD41-42(-CTTT)缺失突变、TATA盒nt-28(AG)突变、IVSII654(CT)突变、CD71-72(+A)移码突变、CD17(AT)无义突变和CD26(GA)突变的荧光定量PCR检测方法。用建立的荧光定量PCR技术检测了上述6种最常见-珠蛋白基因突变类型的阳性样本DNA,其基因分型结果与DNA测序结果完全相符,基因分型结果的特异性和准确率为100%。 应用上述建立的6种-珠蛋白基因突变类型的荧光定量PCR,成功地对20个-地贫家系共68例研究对象进行了基因诊断和产前基因诊断,在66例-地贫患者和携带者中,共有64例检测出了包含在上述6种-珠蛋白基因突变范围内的突变,检出率达97%,共检出13种-珠蛋白基因突变类型,其中CD41-42/N 25例,占37.88%,CD41-42突变纯合子8例,占12.12%,nt-28/N和IVSII654/N各7例,各占10.61%, CD41-42/ IVSII654双重杂合子5例,占7.58%,CD41-42/ nt-28双重杂合子3例,占4.55%,CD71-72/N和CD41-42/ CD71-72双重杂合子各2例,各占3.03%,CD17/N、CD26/N、CD41-42/ CD17双重杂合子、nt-28/ IVSII654双重杂合子和CD71-72/CD26双重杂合子各1例,各占1.52%,未知突变2例,占3.03%。研究结果表明,本研究建立的针对中国人中6种最常见-珠蛋白基因突变类型的荧光定量PCR检测方法,具有特异性高、成本低、快速简便的特点,适合于对大规模人群进行-地贫基因突变的筛查,将为高效、快速、准确地开展-地贫的基因诊断和产前基因诊断,搞好-地贫的防治工作提供一个技术平台。 应用上述建立的6种-珠蛋白基因突变类型的荧光定量PCR分析了1872例海南汉族人和2248例海南黎族人中6种最常见-珠蛋白基因突变类型的基因型和基因频率分布特点。研究结果表明,海南汉、黎族人群均是-地贫的高发群体。在海南汉族人中-地贫的携带率为2.08%,等位基因频率为0.0104,基因突变类型以CD41-42(-CTTT)缺失突变最多见,其次是TATA盒nt-28(AG)突变、IVSII654(CT)突变和CD71-72(+A)移码突变,突变类型较复杂、异质性较高;而在海南黎族人中-地贫的携带率为8.10%,等位基因频率为0.0405,基因突变类型比较单一,几乎全是CD41-42(-CTTT)缺失突变,未发现其它5种-地贫突变类型。以上研究结果初步提供了海南汉、黎族人-地贫基因突变的基因型和基因频率分布特点,为在海南省汉、黎族人群中开展地贫的防治工作提供了科学依据;此外,为研究我国群体遗传学、人类学、民族源流和变迁提供了分子遗传学依据。【关键词】：-珠蛋白基因 珠蛋白生成障碍性 荧光定量 PCR基因分析 海南省 【学位授予单位】：华南热带农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2007【分类号】：R450【DOI】：CNKI:CDMD:2.2007.146806【目录】： 摘要3-5 Abstract5-9 1 前言9-24 1.1 -地中海贫血的研究进展9-19 1.1.1 血红蛋白基因（Hb gene）9-10 1.1.2 -地中海贫血的形成及其分子基础10-12 1.1.3 -地中海贫血基因型与表型的关系12-15 1.1.4 -地中海贫血基因频率及分布15-16 1.1.5 -地中海贫血基因诊断16-19 1.2 实时荧光定量PCR 的研究进展19-23 1.2.1 实时荧光定量PCR 的原理19 1.2.2 实时荧光定量PCR 的荧光化学19-21 1.2.3 实时荧光定量PCR 的特点21 1.2.4 实时荧光定量PCR 的定量方法21-22 1.2.5 实时荧光定量 PCR 技术的应用22-23 1.3 本研究的目的和意义23-24 1.4 技术路线24 2. 材料与方法24-37 2.1 材料24-26 2.1.1 主要实验仪器24-25 2.1.2 主要实验试剂25 2.1.3 研究对象25-26 2.2 实验分析方法26-37 2.2.1 血液标本的采集及处理26 2.2.2 基因组DNA 提取26 2.2.3 建立检测中国人群中6种最常见-地贫基因突变类型的实时荧光定量PCR26-36 2.2.4 分析海南汉、黎族人群中6 种最常见-地中海贫血的基因突变类型、携带率和分布特点36 2.2.5 应用实时荧光定量 PCR 对海南省重型-地中海贫血患者进行基因诊断和产前基因诊断36-37 3. 结果与分析37-70 3.1 -珠蛋白基因DNA 片段的扩增和测序37-38 3.2 用实时荧光定量 PCR 进行中国人群中6 种最常见-地贫基因突变类型检测的基因分型结果及DNA测序验证结果38-62 3.2.1 CD41-42（-CTTT）缺失突变位点实时荧光定量 PCR 的基因分型结果及测序验证结果38-42 3.2.2 TATA 盒nt-28（AG）突变位点实时荧光定量 PCR 的基因分型结果及测序验证结果42-46 3.2.3 IV511654（CT）突变位点实时荧光定量PCR 的基因分型结果及DNA 测序验证结果46-50 3.2.4 CD71-72（+A）移码突变位点实时荧光定量PCR 的基因分型结果及DNA 测序验证结果50-54 3.2.5 CD17（AT）无义突变位点实时荧光定量 PCR 的基因分型结果及 DNA 测序验证结果54-58 3.2.6 CD26（GA）突变位点实时荧光定量 PCR 的基因分型结果及DNA 测序验证结果58-62 3.3 海南汉、黎族人群中6 种最常见-地中海贫血的基因突变类型、携带率和等位基因频率的分布特点62 3.3.1 海南汉族人群中6 种最常见-地中海贫血的基因突变类型、携带率和等位基因频率的分布特点62 3.3.2 海南黎族人群中6 种最常见-地中海贫血的基因突变类型、携带率和等位基因频率的分布特点62 3.4 应用实时荧光定量 PCR 对海南省重型-地中海贫血患者进行基因诊断和产前基因诊断62-70 4. 讨论70-74 4.1 检测中国人群中6 种最常见-地中海贫血基因突变类型的实时荧光定量 PCR 方法的建立70-71 4.2 海南汉、黎族人群中6 种最常见-地中海贫血的基因突变类型和携带率的分布特点71-73 4.3 应用实时荧光定量PCR 对海南省20 个-地中海贫血家系进行基因诊断和产前基因诊断73-74 5 结论74-76 参考文献76-86 英文缩略词表86-88 附录 攻读硕士研究生期间主持、参加的科研课题和发表的科研论文88-90 致谢90 推荐 CAJ下载 不支持迅雷等加速下载工具，请取消加速工具后下载 CAJViewer7.0阅读器支持所有CNKI文件格式，AdobeReader仅支持PDF格式 给遗传投稿 给中国医学文摘(儿科学)投稿 买房.卖房.租房.看房，全国各地小区房价对比 【参考文献】1朱旭,雷一鸣;我国及广西地中海贫血基因缺陷状态的研究状况J;医学文选;2005年04期2周代锋,蔡望伟,王政,王小英;海南省汉族人群中6种-地中海贫血基因突变的研究J;海南医学院学报;2005年05期3邓捷,庄广伦,彭文林,周灿权,梁晓燕,詹前胜,孙宏钰,陈勇,曾艳红;应用荧光PCR技术检测单细胞地中海贫血基因J;中山大学学报(医学科学版);2004年02期4汪洋,宫琳琳,邵淑娟;实时荧光定量PCR在肿瘤研究中的应用J;肿瘤;2004年02期5张蓓;实时荧光定量PCR的研究进展及其应用J;国外医学.临床生物化学与检验学分册;2003年06期6于国龙;实时荧光定量PCR在医学遗传学方面的应用J;国外医学.遗传学分册;2003年03期7李晓红,庄广伦,周灿权,程钢,舒益民,曾瑞萍;荧光定量聚合酶链式反应种植前胚胎-地中海贫血基因诊断J;中国生育健康杂志;2003年04期8邓少丽,罗阳;荧光定量PCR技术及其在临床上的应用J;国外医学.临床生物化学与检验学分册;2002年05期9区采莹,蒙晶,杨健,陈晓丹;海南地区-地中海贫血基因突变类型的研究J;中国优生与遗传杂志;2002年06期10王小红;荧光定量PCR技术研究进展J;国外医学.分子生物学分册;2001年01期【二级参考文献】1周代锋,蔡望伟,王政,蔡兰洁,王小英;海南省黎族人群中-地中海贫血CD26(GA)突变的研究J;海南医学院学报;2004年05期2焦泽旭,庄广伦,周灿权,舒益民,梁晓燕,李洁,张敏芳,邓明芬;对-地中海贫血携带者进行胚胎植入前遗传学诊断J;中华医学杂志;2003年04期3周代锋,蔡望伟,王政,陈倩,王小英;用等位基因特异性PCR筛查海南省黎族人-地中海贫血IVSII654(CT)突变J;海南医学院学报;2003年03期4李晓红,庄广伦,周灿权,程钢,舒益民,曾瑞萍;-地中海贫血种植前基因诊断妊娠成功J;中山医科大学学报;2002年04期5周代锋!海南医学院生化教研室!海口570102,蔡望伟!海南医学院生化教研室!海口570102,蔡兰洁!海南医学院生化教研室!海口570102,邝宇!海南医学院生化教研室!海口570102,周玉英!海南医学院生化教研室!海口570102;海南省黎族人4种地中海贫血基因突变的研究J;海南医学院学报;2001年01期6黄有文,张新华,王荣新,蔡利群,吴志奎,姜葆华,李承军;补肾生血治疗珠蛋白生成障碍性贫血进一步临床研究和免疫功能测定J;临床血液学杂志;2000年02期7黄有文,王荣新,蔡利群,张新华,朱凌;血红蛋白ConstantSpring(HbCS)的临床研究J;中国小儿血液;2000年03期8徐葵,曾瑞萍;对142例地中海贫血基因携带者进行缺失型地中海贫血1基因分析J;中华血液学杂志;1999年04期9潘红飞!533000广西百色,李强!533000广西百色,赵国章,农世光;广西西林县2423份新生儿脐血重型0地中海贫血的检测J;中华血液学杂志;1999年10期10李卫,高枫,林伟雄,苏承武;广西地中海贫血基因突变类型SSCP分析J;广西医科大学学报;1999年03期【相似文献】1柴立民,吴志奎;珠蛋白生成障碍性贫血药物治疗研究进展J;实用儿科临床杂志;2004年11期2韦启泽,刘德培,陶吉中,刘庆辉,贾佩臣,雷学锋,陈松森,梁植权;红系增强子的不同片段对转移的-珠蛋白基因在MEL细胞中表达的作用J;自然科学进展;1997年01期3杨林稚,王申五;-地中海贫血珠蛋白基因的分子克隆J;中国医学科学院学报;1986年S2期4鞠文东,黄峻,何维熊,胡钟旭,黄道连;兄妹二人同患尼曼-皮克病伴珠蛋白生成障碍性贫血J;新医学;2002年03期5陈士友,蒋俶,钱若兰;人体-珠蛋白基因5旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的相互作用J;实验生物学报;1996年04期6周代锋,蔡望伟,王政,蔡兰洁,王小英;海南省黎族人群中-地中海贫血CD26(GA)突变的研究J;海南医学院学报;2004年05期7陈卫东,李建新,房家智;轻型-地中海贫血的-珠蛋白基因突变检测J;现代检验医学杂志;2005年05期8刘元力;胡朝晖;曾征宇;郑建树;朱庆义;地中海贫血一个特殊基因突变的家系分析J;中国医药导报;2008年05期9纪新军,刘德培;-珠蛋白基因簇表达调控的反式作用因子J;国外医学.分子生物学分册;1996年06期10刘志杰,李西平;丁酸类化合物诱导珠蛋白基因表达的研究J;国外医学.儿科学分册;2001年05期应用实时定量RT-PCR技术检测地中海贫血珠蛋白基因的表达-遗传2005年01期 本文献来源中国知网 为了定量检测地中海贫血(地贫)的、和珠蛋白基因表达水平,提取正常成人对照组、正常胎儿对照组和地贫患者组组成的样本DNA,采用反向点杂交法(RDB)分析地贫各种突变类型;提取样本RNA用于进行针对、和珠蛋白基因的荧光实时定量RT PCR(FQRT PCR)。根据FQRT PCR原理,设计合成分别对应于、和珠蛋白基因的3对引物和3条荧光探针,FQRT PCR在ABI7700系统进行。用SPSS10.0对实验数据进行统计学分析,分别计算正常对照组(A/A,/),脐带血组(A/A,/),轻型地贫组(T/A,/),重型地贫组(T/T,/)的、和mRNA比值,其中/分别为4.621.20、7.812.89、13.515.12、188 24374 04;/(+)分别为4 431 17、0 560 49、9 624 37、2 141 58;/(+)分别为0 040 03、0 920 06、0 280 18、0 950 04。由于组与组之间均值变异范围较大,将其进行对数转换后再进行方差分析。结果表明:/与/(+)在所有组与组之间均有显著性差异。/(+)除了在脐带血组和重型地贫组之间无显著性差异外,在其他组与组之间均有显著性差异。实验说明,人类珠蛋白基因的表达水平从正常对照组到重型地贫组急剧下降且以重型地贫【作者单位】：中山大学医学院医学遗传学教研室 广州510080 (韩俊英;曾瑞萍;胡彬);中山大学达安基因诊断中心 广州510080 (程钢;李虎);广西医科大学附属第一医院 南宁530000(赖永榕)【关键词】：地中海贫血/遗传学;珠蛋白基因;基因表达;实时定量RTPCR【基金】：广东省卫生厅五个一重点科研基金资助项目(522202009);211工程资助项目(201038)【分类号】：R446.9【DOI】：cnki:ISSN:0253-9772.0.2005-01-012【正文快照】：地中海贫血(thalassemia,Thal)简称地贫,是一种常见的人类单基因遗传病。其主要是由于珠蛋白基因缺陷导致珠蛋白链合成障碍,或链和链合成失去平衡而导致的溶血性贫血。常见的地贫类型主要有地贫和地贫两大类。引起地贫的以点突变为主。已报道的基因点突变已达300种之多1。Huisman TH课题组用RT PCR同位素标记法对地贫、地贫及持续性胎儿血红蛋白增多症(hereditarypersistanceoffetalhemoglobin,HPFH)等多种地贫类型进行了珠蛋白基因表达定量研究28,Pistidda等利用高效液相色谱分析法(high performanceliquiWhole blood samples were collected from 100 normal healthy adults, from umbilical cord of 33 newborn infants, 111 individuals with -thalassemia minor (T/A,/) and 39 with -thalassemia major (T/T,/). Prior to quantitative analysis of globin gene expression, DNA was extracted from all blood samples and used for -thalassemia genotype analysis. Different types of globin gene mutations were analyzed using reverse dot blotting (RDB) method. Total RNA were extracted and subjected to real-time RT-PCR for quantitative measurement of , and globin mRNA using three sets of primers and fluorescent-labeled probes, designed according to the sequences of , and human globin gene. Real-time RT-PCR was performed in ABI 7700 system. Following the real-time RT-PCR, the mean values of , and globin mRNA were calculated and the ratios of /, /(+) and /(+) were determined to characterize the relative expression levels of different globin genes among normal adult, infant, -thalassemia minor and -thalassemia major patients. The resultant data were analyzed using SPSS 10.0 software to determine statistical significance of human globin gene expression among normal controls and -thalassemia patients. Due to vast variations of the mean globin gene mRNA levels among different groups, log conversion of /+1, /(+)+1 and /(+) +1 was used for statistical analyses and intergroup comparison. The / globin gene mRNA ratios were determined to be 4.621.20, 7.812.89, 13.515.12, and 188.24374.04 for normal healthy adult (A/A,/), infant (A/A,/), -thalassemia minor (T/A,/) and -thalassemia major(T/T,/) respectively. The /(+) ratios were 4.431.17, 0.560.49, 9.624.37, and 2.141.58 for normal healthy adult (A/A,/), infant (A/A,/), -thalassemia minor (T/A,/) and -thalassemia major(T/T,/) respectively. The/(+) ratios were 0.040.03, 0.920.06, 0.280.18, and 0.950.04 for normal healthy adult (A/A,/), infant (A/A,/), -thalassemia minor (T/A,/) and -thalassemia major(T/T,/) respectively. Following statistical analyses, the / and /(+) globin gene mRNA ratios were significantly different among four different groups (normal adult, normal infant, -thalassemia minor and -thalassemia major). The /(+) globin gene mRNA ratio was significantly different among all groups except for between infant and -thalassemia major patients. Human globin gene mRNA levels decrease progressively and dramatically from normal adults to -thalassemia patients with -thalassemia major having the lowest levels. On the other hand, the globin gene mRNA levels increase progressively from normal adult to -thalassemia patients with -thalassemia major having the highest levels. Infants have relatively lower levels of but higher levels of globin gene mRNA as compared to those in normal adults. Thus, the relative expression levels of , or globin genes varied but inter-related among different ages of normal individuals and different -thalassemia genotypes.【Keyword】：-thalassemia/genetics;globin gene;gene expression;real-time RT-PCRBr J Haematol. 2009 Oct 5. Epub ahead of printMultiplex ligation-dependent probe amplification screening of isolated increased HbF levels revealed three cases of novel rearrangements/deletions in the beta-globin gene cluster.Lee ST, Yoo EH, Kim JY, Kim JW, Ki CS.Department of Laboratory Medicine and Genetics, Samsung Medical Centre, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul, Korea.Summary Investigations of naturally occurring mutations, such as the deletional thalassaemias and hereditary persistence of fetal haemoglobins (HPFHs), have brought many insights into human globin switching, but limited data have been reported so far. We selected 15 individuals with elevated fetal haemoglobin (HbF) levels (5%) from a previous screening of 27 006 Korean individuals and analysed dosage changes of the globin gene cluster using multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). Dosage changes detected by the MLPA probes were followed up with gap-polymerase chain reaction and sequence analysis. Three subjects were found to have deletions in the globin gene cluster, including a beta-thalassaemia due to deletion of HBB (beta-globin gene), an HPFH due to deletions of HBD (delta-globin gene) and HBB, and an HPFH due to a novel HBG2-HBG1 fusion gene consisting of exons 1 and 2 of HBG2 (G)gamma-globin gene) and exon 3 of HBG1 (A)gamma-globin gene). The case with the HBG2-HBG1 fusion suggested the existence of another mechanism for the reactivation of HBG2 and HBG1. The IVS2 of HBG2 and HBG1might play a role in HbF regulation, and combinations of specific polymorphisms could influence the reactivation of these genes in adults.PMID: 19807730 PubMed - as supplied by publisherLinkOut - more resourcesFull Text Sources: Blackwell Publishing Swets Information ServicesMedical: Beta Thalassemia - Genetic Alliance【中文篇名】应用实时定量RT-PCR技术检测地中海贫血珠蛋白基因的表达【英文篇名】Quantitative Analysis of Human Globin Gene Expression in -thalassemia Using Real-Time RT-PCR【编著】韩俊英%曾瑞萍%程钢%胡彬%李虎%赖永榕%HAN Jun-Ying%ZENG Rui-Ping%CHENG Gang%HU Bin%LI Hu%LAI Yong-Rong 【期刊】遗传 HEREDITAS(BEIJING) 2005年 27卷 1期【中文摘要】为了定量检测地中海贫血(地贫)的、和珠蛋白基因表达水平, 提取正常成人对照组、正常胎儿对照组和地贫患者组组成的样本 DNA,采用反向点杂交法(RDB)分析地贫各种突变类型;提取样本RNA用于进行针对、和珠蛋白基因的荧光实时定量RT-PCR(FQ RT-PCR).根据FQ RT-PCR原理,设计合成分别对应于、和珠蛋白基因的3对引物和3条荧光探针,FQ RT-PCR在ABI 7700系统进行.用SPSS 10.0对实验数据进行统计学分析,分别计算正常对照组 (A/A,