微生物实验培养检测保存.ppt

霉菌的实验材料,谭跃 2012 9.20,（1）培养基制备的一般程序,e.加棉塞，包装。,鉴定是否有菌可将培养基置于37 培养24小时，然后观察,注意,因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫正pH时应比所需的pH高,实验室常用培养基,肉膏蛋白胨培养基： 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15-20g，水1000ml，pH7.0-7.2； 淀粉琼脂培养基（高氏1号培养基）： 可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，FeSO40.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.0-7.2; PDA培养基： 马铃薯（去皮）200g，蔗糖或葡萄糖15g，琼脂15-20g，水1000ml;,实验原理,二 消毒、灭菌及倒平板,步骤,半固体培养基：穿刺接种 液体培养基接种 普通琼脂培养基：涂布平板，平板划线接种，斜面划线接种 浅盘固体接种,（2）接种,划线分离,划线接种注意要点,划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触,以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂. 第一次划线应占平皿面积的1/10,以后每次划线约占面积的1/41/5. 划线为连续划线,不能间断.应占满平皿.划线不能交叉重复. 每次划完后接种环应灭菌.,稀释分离涂布平板,稀释分离倾注平板,真菌分离、纯化,利用低碳氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。 一般采用PDA培养基 改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。 有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。 将分离得到的单菌落分别接种到单个平板上,颜色反应：分离特定的菌株；,牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；,待分离的微生物的生长特征明显不同,菌落观察,霉菌 放线菌 要求：每种微生物选择典型菌落1-2个，列表描述细菌、霉菌、酵母、放线菌的菌落形态特征,不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般 都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微 生物进行分类、鉴定的重要依据。,（4）菌种保藏,最常见的保藏方法：斜面 细菌的保藏：甘油保藏 真菌的保藏：石蜡油保藏、孢子保藏,几种常用菌种保藏方法的比较,1比浊计数法,浊细菌悬浮液的浊度,细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比,（一）实验原理,2. 酵母的血球计数板计数,0.1ml菌液,提问：数了125个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是多少？ (90个125) * 400 / 0.1ml =2880个/ml 适用范围：酵母及较大细菌，如细菌个体太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。,数酵母数目，（一般数125个小格），折算样品酵母菌浓度；,酵母菌悬液 显微镜、血球计数板、分光光度计等。,（三）实验器材,1了解血球计数板构造 显微镜下找到血球计数板的各种格子,（四）实验步骤,2、目测酵母菌大致浓度。 3、稀释酵母菌悬液，直至其个数在计数范围内：每小格2-5个。 4、计算出酵母浓度，同时采用分光光度计测定其OD。 5、将原酵母菌液稀释至5-7个梯度，分别测定其浓度。,以OD值为横坐标，浓度为纵坐标，做标准曲线。,（五）数据处理,霉菌形态及培养方法,1培养基的选择,目前国标方法中使用的培养基有:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO),其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长,而CAO则适合于高渗性霉菌生长,酵母菌几乎不长。,霉菌菌落,有菌丝,可在显微镜下观察到 孢子 菌丝均可繁殖 水浸片制作 视频,/special/show_2674506/lF_5JD7DK-AMrPwy.html,讨论,霉菌水饺引发速冻食品卫生标准问题/tv/2005-10-26/094511801.html,1培养基选择,有的菌株即使污染数量不多,但其产生的霉菌毒素却危害较大,因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度,重要的是要知道污染菌的菌相,才能更好地判断被污染食品的安全程度。为此,国外有些研究者设计出各类选择性培养基,可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方:酵母提取汁20g,蛋白胨10g,柠檬酸铁铵0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。,2接种方式,2.1主要有倾注法和涂布法两种。目前国际方法中采用倾注法,但近来国际上有不少学者认为霉菌计数采用涂 2.2对霉菌计数来说,涂抹法有以下几方面优越于倾注法:培养出的霉菌菌落数较多;培养所需的时间较短;霉菌孢子、菌落形态特征发育完全,便于鉴定。这是因为绝大多数霉菌是好氧的,在培养基表面生长快,发育好,而混在培养基中发育就受影响,而且在培养基倾注时霉菌孢子易受热损伤。布法更合适。,3培养温度,3.1大部分菌种的最适温度为2530。 3.2若有特殊培养目的,则应适当调节培养温度,4培养时间,如果只要作霉菌计数,培养34天已基本达到目的,但如果还要进一步分类鉴定,则需要培养更长的时间(714天)。,5最适计数范围,5.1应尽量选择1050个/平皿的稀释度进行霉菌计数。 5.2为控制霉菌的生长速度和菌落的生长范围,可在培养基中添加少量抗生素,如氯霉素(50100mg/L),金霉素(20100mg/L),庆大霉素(50mg/L),土霉素(100mg/L)等。,6霉菌检测过程中应特别注意的事项,6.1 由于霉菌检测所需的时间较长,中间又需要多次观察,因此实验前一定要作好实验计划,明确观察记录的时间。 6.2 霉菌孢子通过空气传播,所以实验时应保持实验室平静,减少空气流通;操作时手脚要快,动作要轻,特别是培养过程中,如果观察时动作过大,早期生长出的霉菌孢子就会在培养基内扩散,形成新的菌落,导致结果不准确。 6.3实验前应认真做好全面的消毒工作,包括操作人员手指、实验室空间、实验台等,实验后应第一时间将有霉菌的培养物高压灭菌,防止进一步扩散。 6.4 对使用的菌株的生理、生态、形态、毒理、致病性必需有充分的了解,并作好相应的防扩措施,防止污染其它物品。,7霉菌控制,7.1利用排气换气，减少湿度 7.2每半月用甲醛