地龙活性蛋白的分离提取

单位代码 10006 学 号 10101048 分类号 R284.2 毕业设计(论文)地龙活性蛋白的分离提取学院名称生物与医学工程学院专业名称生物医学工程学生姓名李 秦指导教师荣 龙 2014年6月地龙活性蛋白的分离提取李秦北京航空航天大学北京航空航天大学本科生毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目：地龙活性蛋白的分离提取 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求：1. 根据文献,学习各种地龙活性蛋白的提取方法，如回流法，超声法，微波法，闪提法等； 2. 查阅文献，确定各方法的影响因素，学习正交实验的设计思路; 3. 根据实验室的实验条件，进行闪提法提取地龙活性蛋白的试验,探索工艺流程，优化工艺条件； 4进行正交实验，确定最优条件； 5. 根据所得的最优条件完成蚯蚓多肽、地龙活性蛋白的联合提取实验。 、毕业设计（论文）工作内容：（1）根据地龙研究的相关文献，进一步查阅资料，了解国内外对地龙活性蛋白提取分离的研究状况；（1月-3月） （2）翻译所查得的文献，根据文献和实际情况制定实验方案；（3月上旬） （3）进行闪提法的提取实验，探索工艺流程；（3月-4月上旬） （4）进行正交实验，确定最优工艺条件；（4月中旬） （5）按照确定的最优工艺条件，进行重复实验，检测地龙活性蛋白的含量；（4月下旬） （6）完成地龙多肽和地龙活性蛋白的联合提取；（5月上旬） （7）撰写毕业设计论文和PPT，准备答辩。（5月-6月） 、主要参考资料：1廖怡, 荣永海, 荣龙. 从蚯蚓中联合提取抗氧化酶 SOD, CAT 的方法研究J. 天然产物研究与开发, 2012, 24(11): 1538-1544. 2商桂娜, 荣永海, 荣龙. 蚯蚓 GSHPx 提取与纯化的研究J. 天然产物研究与开发, 2013, 25(1): 76-82. 3Wenli Li,Chong Wang,Zhenjun Sun.Vermipharmaceuticals and active proteins isolated from earthworms.Pedobiologia - International Journal of Soil Biology.Pedobiologia 54S (2011) S49-S56; 4Prochzkov P, Dvok J, ilerov M, et al. Molecular characterization of the iron binding protein ferritin in Eisenia andrei earthwormsJ. Gene, 2011, 485(2): 73-80. 5毛泉明, 张宁, 王忆勤, 等. 地龙中蛋白质的提取工艺研究J. 上海中医药杂志, 2010, 44(3): 74-77. 6杨丰云, 付廷明, 郭立玮, 等. 响应面分析法优化湿法超微粉碎地龙活性蛋白的提取工艺J. 中国实验方剂学杂志, 2012, 18(10): 33-37. 生物与医学工程 学院 生物医学工程 专业类 101012 班学生 李秦 毕业设计（论文）时间： 2014 年 3 月 1 日至 2014 年 6 月 6 日答辩时间： 年 月 日 成 绩： 指导教师： 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）： 系（教研室） 主任（签字）： 注：任务书应该附在已完成的毕业设计（论文）的首页。 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 页本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。作者：李秦签字：时间：2014年 6 月北京航空航天大学毕业设计(论文) 第III页地龙活性蛋白的分离提取学 生：李 秦指导教师：荣 龙摘 要地龙(Geosaurus)，又名蚯蚓，属环节动物门寡毛纲类，在我国是一种非常传统的动物类中药材。10年版的中华药典中，记载着它的功效为清热定惊，通络，平喘，利尿。地龙体内富含蛋白质，含有胶原酶、纤溶酶、蚓激酶、核酸、微量元素等多种成分，具有改善微循环、溶解血栓等作用。本实验的目的是探索并优化一种地龙体内活性蛋白的分离与提取方法，并使工艺更适合大批量的、药用的生产。传统的地龙蛋白提取方法主要有匀浆法，浸泡煎煮法等。这些提取工艺、提取条件等都还不成熟，主要缺点包括提取时间长，提取效率低，获得的蛋白质纯度低并且不适于大量的工业生产。因而本实验在提取工艺流程中综合性的应用了闪提、超声与离心等工艺手段，缩短了提取时间并提高了提取效率，再与一些纯化处理过程互相配合，提取出含有多种地龙活性蛋白的蚓多酶。本实验通过单因素实验与正交试验设计，对影响蛋白质收率的一些因素，包括固液比，pH值和闪提时间进行了优化。本实验得到的最佳工艺条件是：固液比1:4，pH值7.7，闪提时间30s；得到的蛋白质含量为13.52%。关键词：地龙，活性蛋白，提取工艺，正交试验，蚓激酶Extraction and separation of the active proteins from earthwormsAuthor :LI Qin Tutor : RONG LongAbstractGeosaurus, also known as earthworms, belongs to Annelida Oligochaeta class. In our country,it is also an important kind of traditional animal medicine. In the Chinese Pharmacopoeia of 2010 edition, its efficacy is recorded as driving heat and anxious , meridians, asthma, diuretic. Geosaurus is rich in proteins, which contains a variety of ingredients collagenase, plasmin, PPA, nucleic acids, trace elements etc. with the effect of improving microciculation and thrombolytic. The purpose of this experiment is to explore and optimize the separation and extraction method of active proteins from earthworms and make the process more suitable for large-scale pharmaceutical production.The traditional extraction methods of earthworm mainly includes homogenizing and soake-boiling. These process, and the conditions are not ripe yet. The major drawbacks include long extraction time, low extraction efficiency, low protein purity obtained and they are not suitable for large-scale pharmaceutical production. This experiment uses flash extraction, ultrasound and centrifugal technology comprehensively, with the co-ordination of some purification process to make extraction time shorter and efficiency higher in the process of extracting the earthworm multi-enzyme protein containing a variety of active proteins. In this study, single factor experiment and orthogonal experimental design was used to optimize some factors that may affect the yield of the protein, including solid-liquid ratio, pH and duration of flash extraction.The optimum conditions of the experiment are: liquid ratio:1:4, pH:7.7, duration of flash extraction:30s ; the extraction rate is 13.52% .Key words：Geosaurus, active protein, extraction process, orthogonal experimental design, lumbrokinase目录1绪论11.1课题背景及目的11.1.1地龙11.1.2地龙活性蛋白21.1.3地龙活性蛋白的分离提取方法31.2 国内外研究现状41.3 研究内容及方法52 实验材料与方法62.1 实验材料62.1.1 原材料62.1.2 试剂62.1.3 仪器设备62.2 实验方法72.2.1 原材料含水量的测定72.2.2 实验方法一 冷冻干燥法72.2.3 实验方法二 硫酸铵沉淀法92.2.4 实验方法三 乙醇乙醚双脱水法132.3地龙提取物中蛋白质含量的测定162.3.1检测原理162.3.2考马斯亮蓝法162.3.3地龙提取物中蛋白质含量的测定172.4 单因素试验设计172.5 正交试验设计203实验结果与讨论243.1三种工艺的提取结果243.2单因素试验结果253.3正交试验结果28结论30致谢32参考文献34 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第36页1绪论1.1课题背景及目的1.1.1地龙地龙，俗名曲蟮、蚯蚓，属环节动物门寡毛纲类，全世界约有2500余种，仅我国记录就有229种1，其分布地域十分广泛，亚洲、南美洲、北美洲、大洋洲、欧洲甚至非洲热带地区都有地龙的足迹。蚯蚓体长约60mm-120mm，体重约0.7-4g，最大的蚯蚓有1.5kg。其身体呈长圆筒形，褐色稍淡，约由100多个体节组成。地龙是一种非常典型的腐食性动物，喜生活在潮湿、疏松和肥沃的土壤中。在农业生产当中，地龙有着非常广泛的用途，地龙以土壤中的动植物碎屑为食，属于分解者，经常在地下钻洞，可以起到疏松土壤的作用，并且使水分和肥料易于进入而提高土壤的肥力，十分有利于植物的生长。地龙还可以作为家禽的饲料，是鸡、鸭等各类家禽的天然肉类饲料。地龙在我国是一种非常传统的动物类中药材，10年版的中华药典记载，地龙的功效为清热定惊，通络，平喘，利尿2。本草纲目虫部中记载地龙药用功效为“主伤寒疟疾大热狂烦，及大人小儿小便不通，急慢惊风，历节风痛，肾脏风注，头风，齿痛，风热赤眼，木舌，喉痹，鼻息，聤耳，秃疮，瘰疬，卵肿，脱肛，解蜘蛛毒，疗蚰蜒入耳”。 神农本草经中记载地龙功效为“蚯蚓味寒，主蛇瘕，去三虫伏尸，鬼疰蛊毒，杀长虫，仍自化水生平之”。本草再新中记载地龙“入肝、脾、肺三经”，其主要药用功效有“清热，平肝，止喘，通络。治高热狂躁，惊风抽搐，风热头痛，目赤，中风半身不遂，喘息，喉痹，关节疼痛，齿衄，小便不通，瘰疬。痄腮，疮疡。”日华子诸家本草中记载其主要药用功效为“治中风并痫疾，去三虫，天行热疾，喉痹，蛇虫伤”。在国外，曾有报道在大烟山深处的切诺基印第安人是如何用地龙制成的药膏拔出体内的刺的3,4。可见，地龙的药用功效早在数千年前就被世界各地的人们所意识到，并被积极的应用于临床诊治中去。地龙如今在处理垃圾中的有机废物，降解环境中的污染物和为人类提供蛋白质新来源等方面的功用都日益受到人们的重视，如今已经被成功地应用于将有机废物转换有可能被用作能源的生物有机质5。更近一段时间，现代医学也开始了对地龙药用功效的探索和实践，从地龙中提取药物的研究，也即被称为属于绿色生物医学研究的一部分的研究数量一直在增加。因此，即使原来的利用价值在传统医学中已经被人们了解了几千年，它最近才成为一种国际热门药物。随着生物医学技术的发展，科学家们重新发现了地龙的药用价值6。地龙的药用价值主要是源于其体内含有的多种多样的化学成分，主要包括：(1)蚯蚓蛋白酶(蚓激酶，胶原酶，超氧化物歧化酶，胆碱酯酶，过氧化氢酶等) ；(2)金属结合蛋白(金属硫蛋白，钙调蛋白结合蛋白) ，(3)其他活性蛋白质，包括那些能够促进增值功能的蛋白，还有其他抗肿瘤蛋白和糖蛋白；(4)活性肽(肠流动性调节肽，抗菌肽) ，(5)蚯蚓代谢物(6)特殊的有机酸(琥珀酸，十二烷酸，和不饱和脂肪酸)和(7)其它组分如嘌呤，维生素B，酪氨酸和硒7,8。现代医学研究表明，地龙煎剂可改变血流变性，促进血液循环，抑制血小板，抗血栓形成，还具有可抗肿瘤，抗菌，利尿，促进皮肤新陈代谢等作用9。1.1.2地龙活性蛋白地龙体内蛋白质含量十分丰富，约占干体的5666%。地龙活性蛋白质中含有多种游离氨基酸，它们是地龙最主要的营养成分。其蛋白质由18种氨基酸组成，按照含量的高低，包含有亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氯酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸和酪氨酸等。人体必需的八种游离氨基酸都包括在内10。因此可以看出地龙是一种纯天然全面的动物性蛋白源。地龙生活在充满各种病原体的环境中。从生理学和进化学上来说，地龙能生存在这样的环境中，一定受益于在发展进化的过程中对各种环境病原体都有效的高效防御机制的发展，包括其生产的一些抗微生物物质，特别是活性的蛋白质和酶11。地龙活性蛋白提取自地龙，含有胶原酶、纤溶酶、蚓激酶、核酸、微量元素等多种成分。地龙通过高科技提取，目前已经成功研发出多款心脑血管药物产品。目前已广泛用于临床，并越来越多地用在心、脑血管、内分泌，呼吸系统等疾病的预防和治疗中。地龙活性蛋白对体内的凝血系统和纤溶系统具有广泛的影响，临床表明，地龙活性蛋白可明显降低家兔血浆粘度、全血高切低切粘度，红细胞压积、血沉方程指数和红细胞刚性指数；体外实验还表明，地龙提取液具有很好的抗凝作用。现代社会严重威胁到人类的生命和健康的血管栓塞性疾病如脑血栓、血栓闭塞性脉管炎以及冠心病等是一类对人类健康危害极大的疾病，尤其是心脑血管血栓栓塞症，死亡率已跃居首位12。目前用于治疗这些疾病的药物虽有很多，但由于副作用大等缺陷使它们的应用受到一定程度的限制。而从地龙组织中萃取的具有溶解血栓作用的地龙活性蛋白，原料来源方便经济而且绿色环保，副作用小。因此，地龙活性蛋白的成功提取对于溶栓药物的研发具有重要的意义。地龙体内的活性蛋白酶可分为五类，包括(1)溶栓酶；(2)胆酰酯酶；(3)消化酶；(4)抗氧化酶和(5)其他酶类。溶栓酶包括(1)纤溶酶；(2)纤溶酶原激活剂；(3)蚓激酶和(4)胶原酶。抗氧化酶包括(1)超氧化物歧化酶；(2)过氧化氢酶；(3)过氧化物酶；(4)谷胱甘肽过氧化物酶；(5)谷胱甘肽还原酶；(6)谷胱甘肽转硫酶；(7)葡萄糖氧化酶13。1.1.3地龙活性蛋白的分离提取方法(1)浸泡煎煮法浸泡煎煮法是一种非常传统的提取手段，主要是通过对药材原材料长时间的浸泡并随后高温煮沸，使细胞成分受到破坏，进而使水溶性的物质溶出。这种方法最大的缺陷是试验时间长，效率低，功耗大，一般用浸泡煎煮法需要两个小时以上，并且高温会破坏一些有效成分，比如破坏蛋白质的活性，使其发生降解现象，相对来说是一种效率低、功耗大的方法。(2)超声法超声波提取动植物类中药材，首先将提取溶剂加入容器中，然后将材料根据提取流程的需要粉碎或者切成颗粒状，并且放入提取溶剂；容器的外壁粘接换能器振子，或者将振子密封于不锈钢盒，再插入已经粉碎了的或切成颗粒状并且已经溶解到提取溶剂中的提取溶媒中；随后开启超声波发生器，换能器振子向提取溶媒中发出具有一定强度的超声波，利用超声波在提取溶剂中产生的“空化效应”，即存在于液体中的微气核空化泡在声波的作用下振动，当声压达到一定值时发生生长和崩溃的动力学过程，振动匀化作用和加速分子运动作用等一方面都可以有效地破碎药材的细胞壁，使有效成分呈游离状态并逐渐溶入提取溶媒中，另一方面也可加速提取溶媒的分子运动，使药材中的有效成分在提取溶媒中得以快速地互相接触，相互溶合、混合。超声法提取具有提取温度低的优点，该优点使得超声法可以不破坏一些中草药中的一些热不稳定，易氧化，易水解的成分；并且超声法的提取时间相对较短，提取一般在0.5-2个小时左右即可。(3)微波法微波提取技术是利用频率为300MHz-300GHz的电磁波辐射在交频磁场和电场的作用下，通过不断改变电场的方向，使得提取物内的极性分子取向随之变化，大大提高了反应物分子运动及相线间的碰撞频率，使分子在极短的时间内达到活化状态，相比较传统加热方式，优点有加热均匀，且热效率较高；过程易于控制，试剂用量少，节能，污染小等等。(4)湿法超微粉碎湿法超微粉碎是将药材与溶剂一起加入到粉碎机，应用强大机械振动研磨组织，使溶剂迅速到达组织内部，通过减小药材粒径、增加溶出面积、缩短成分溶沿路径、从而提高提取效率的一种提取新技术。该提取技术在较短的时间内即可完成药物提取，且整个操作过程可控制在低温条件下进行，尤其适用于一些热敏性药物的提取，如蛋白质、多肽类成分。(5) 闪提法闪提法是一种较新的工艺流程方法，使用的仪器是闪式提取器，闪式提取器是一种可以用于动植物软、硬组织粉碎的新型提取器，依靠高速机械剪切力和超动分子渗滤技术，在室温及溶剂存在下数十秒钟内把植物的根、茎、叶、花、果实等物料在组织层面打碎至细微颗粒，并且使有效的成分迅速地达到组织层面的内外平衡，通过过滤达到提取的目的。使用闪提法进行动植物药材有效成分提取的最大优势是提取时间短，提取效率高，并且能够免受热破坏，溶剂用量少，能够多快好省地达到预定的提取效果。1.2 国内外研究现状地龙的营养保健价值和它的医药工效， 与其中的活性蛋白质组分有很大的关系，因此活性蛋白提取的研究比较活跃。在2007年的中成药杂志上，房泽海， 冯怡，徐德生等人的文章鲜地龙平喘活性蛋白提取工艺研究中通过正交试验得到的最佳工艺条件是：鲜地龙加2倍体积pH68的磷酸盐缓冲液，在低温(4)下匀浆并静置抽提3 h,4离心取上清液，80%硫酸铵固体盐析取沉淀。沉淀用20 mmol/L、pH值为6.8的磷酸盐缓冲液悬浮，透析除盐，所得蛋白液4离心，上清液冷冻干燥得到地龙平喘活性蛋白。在2010年的上海中医药杂志中，毛泉明、张宁、王忆勤等人的文章地龙中蛋白质的提取工艺研究中通过正交试验得到，地龙的最佳提取工艺条件是适量的地龙药材加10倍量的水， 浸泡40min，煎煮3次，第1次90min，第2，第3次分别为60min19。在2012年的中国实验方剂学杂志杂志中杨丰云、付廷明、郭立玮的文章响应面分析法优化湿法超微粉碎地龙活性蛋白的提取工艺中通过响应面分析法优化了提取工艺并得到，湿法超微粉碎提取地龙活性蛋白的最佳工艺条件为浸泡时间4.7 h，料液比l：11，提取温度17，粉碎时间10min。在此条件下蛋白质得率3.46%20。1.3 研究内容及方法本研究的主要内容是：确定一种效率较高的地龙活性蛋白的提取方法，以蛋白质收率为主要衡量指标，并且通过单因素试验和正交试验优化提取条件，最终得到最佳提取工艺。本研究方法的第一步是探索合适的地龙活性蛋白提取工艺流程，通过对闪提，离心，超声，冷冻干燥，硫酸铵沉淀，乙醇乙醚双脱水等工艺手段的流程进行适当的排序和组合，比较各种干燥脱水方式的优缺点，探索最合适的工艺流程；第二步确定了工艺流程之后，对地龙活性蛋白分离提取的影响因素，比如固液比，pH值和闪提时间进行单因素试验，为正交试验做准备；第三步是对闪提方法的几种因素进行正交试验，以优选正交实验条件，确定最佳的条件，优化提取工艺；第四步是提取地龙活性蛋白，按照优化的工艺，重复三次验证提取试验，检测蛋白含量，计算平均值，得到最优化条件下地龙活性蛋白的含量值；第五步是实现与地龙多肽的联合提取、 与“地龙多肽提取”中的提取工艺进行整合，实现与地龙多肽的联合提取。2 实验材料与方法2.1 实验材料2.1.1 原材料地龙冷冻鲜品：地龙品种为赤子爱胜蚓，由天津蚓福生物科技开发有限公司提供；2.1.2 试剂实验中所用到的试剂主要有：(1)无水乙醇，产自北京化工厂，分析纯；(2)氢氧化钠，产自北京化工厂，分析纯；(3)盐酸，产自北京化工厂，分析纯；(4)考马斯亮蓝，产自北京化工厂，分析纯；(5)牛血清蛋白，产自北京化工厂，分析纯；(6)硫酸铵，产自北京化工厂，分析纯；(7)乙醚，产自北京化工厂，分析纯；2.1.3 仪器设备 (1)HBE-50S闪式提取器，河南金鼎科技发展有限公司；(2)DHG-9071A型电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；(3)循环水式多用真空泵，上海知信实验仪器技术有限公司；(4)离心机，上海安亭科学仪器厂；(5)DZF-6050型真空干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；(6)高速低温离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；(7)低温冰箱，美国赛默飞世尔科技公司；(8)冷冻干燥机，美国SP Scientific公司；(9)211型pH计，意大利哈纳公司；(10)分光广度计，美国伯乐Bio-Rad生命医学产品有限公司；(12)SY-1000E型多用途恒温超声提取机，北京弘祥隆生物技术股份有限公司；(13)HH-4型数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；(14)SL-N型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司；(15)漏斗，烧杯，量筒，滴瓶等，实验室提供；2.2 实验方法2.2.1 原材料含水量的测定为了得到冻蚯蚓的干重，需要提前对冻蚯蚓的含水量进行测量：称量一定质量的在-20冷冻的蚯蚓，其质量记为m1；在电热恒温干燥箱中进行若干小时的干燥，直到其质量称量时不再发生变化，质量记为m2。则蚯蚓的含水量记为P，由以下公式计算得到： P=m1-m2m1100% (2.1)以上实验步骤重复三次，并利用公式(2.1)计算蚯蚓含水量的平均值，作为实验中所用冻蚯蚓的标准含水量。经测定，实验中所用冻蚯蚓的标准含水量为84.3%。2.2.2 实验方法一 冷冻干燥法这种提取方法将低温离心得到的上清进行冷冻干燥，干燥中的粉末即所要提取的含有多种地龙活性蛋白的蚓多酶。具体步骤如下：蚓多酶的分离提取(a)剪碎首先称量一定质量的冻蚯蚓，加入体积分数为66%的酒精，其体积为冻蚯蚓质量的4倍。酒精逐渐加入，加入之后将块状的冻蚯蚓剪碎，避免硬块状的冻蚯蚓存在；(b)闪提将酒精和冻蚯蚓混匀之后，用闪式提取器连续提取1分钟，闪式提取器电压调至110V；(c)离心闪提结束之后进行离心，离心的注意事项是倒入各个离心容器中的悬浊液配平要准确，以免离心失败。该次离心使用的是低速离心机，离心的条件是5000r/min，时间15min，使沉淀与上清分离；(d)闪提离心之后，取沉淀，加入蒸馏水，其体积为冻蚯蚓质量的4倍。用pH计调节悬浊液的pH为7.2，然后用闪式提取器进行闪提。闪提的时间为1min，电压调至110V；(e)超声闪提之后，悬浊液的pH会有一定程度的下降，再用pH计将悬浊液的pH调为7.2，放入恒温超声提取机进行超声提取，温度设置在38，超声提取时间设置为30min，超声功率为800W，超声间隙时间0.3s，工作时间0.7s；(f)冷冻超声结束后，立即将悬浊液装瓶，放入-70的低温冰箱进行冷冻，冷冻时间为12h；(g)融化冷冻12h之后，从-70的低温冰箱中将悬浊液取出，进行常温水浴融化，至瓶中无冷冻形成的硬块；(h)低温离心融化完成后，将悬浊液进行高速低温离心。使用高速低温离心机的注意事项时进行严格的配平。离心的条件是温度为-4，转速为11000r/min，时间为50min；(i)冷冻干燥低温离心完成后，取上清液，测量上清液体积，然后取50mL上清液，倒入培养皿中，放入冷冻干燥机，进行冷冻干燥12h，冻成的粉末状固体中含有所要提取的蚓多酶。冷冻干燥法的具体流程如图2.1。 4倍66%酒精调pH7.2加4倍水，调pH7.2冻蚯蚓闪提1min离心15min闪提1min沉淀超声30min-70冷冻12h融化-4，离心50min上清冷冻干燥蚓多酶 图 2.1 冷冻干燥法流程图2.2.3 实验方法二 硫酸铵沉淀法这种提取方法的原理是利用蛋白质的盐析现象，不同蛋白质在不同盐浓度条件下溶解度不同。在低温离心得到的上清中加入一定质量的硫酸铵至饱和，析出的固体经过超纯水透析之后，便得到含有多种地龙活性蛋白的蚓多酶。具体步骤如下：蚓多酶的分离提取(a)剪碎首先称量一定质量的冻蚯蚓，加入体积分数为66%的酒精，其体积为冻蚯蚓质量的4倍。酒精逐渐加入，加入之后将块状的冻蚯蚓剪碎，避免硬块状的冻蚯蚓存在；(b)闪提将酒精和冻蚯蚓混匀之后，用闪式提取器连续提取1分钟，闪式提取器电压调至110V；(c)离心闪提结束之后进行离心，离心的注意事项是倒入各个离心容器中的悬浊液配平要准确，以免离心失败。该次离心使用的是低速离心机，离心的条件是5000r/min，时间15min，使沉淀与上清分离；(d)闪提离心之后，取沉淀，加入蒸馏水，其体积为冻蚯蚓质量的4倍。用pH计调节悬浊液的pH为7.2，然后用闪式提取器进行闪提。闪提的时间为1min，电压调至110V；(e)超声闪提之后，悬浊液的pH会有一定程度的下降，再用pH计将悬浊液的pH调为7.2，放入恒温超声提取机进行超声提取，温度设置在38，超声提取时间设置为30min，超声功率为800W，超声间隙时间0.3s，工作时间0.7s；(f)冷冻超声结束后，立即将悬浊液装瓶，放入-70的低温冰箱进行冷冻，冷冻时间为12h；(g)融化冷冻12h之后，从-70的低温冰箱中将悬浊液取出，进行常温水浴融化，至瓶中无冷冻形成的硬块；(h)低温离心融化完成后，将悬浊液进行高速低温离心。使用高速低温离心机的注意事项时进行严格的配平。离心的条件是温度为-4，转速为11000r/min，时间为50min；(i)加入硫酸铵固体至80%饱和度低温离心完成后，取上清液，测量上清液体积；然后加入硫酸铵固体至80%饱和度，即每100mL上清液加入51.6g的硫酸铵固体。在-20静置1h；(j)低温离心静置1h后，将悬浊液进行高速低温离心。使用高速低温离心机的注意事项时进行严格的配平。离心的条件是温度为-4，转速为11000r/min，时间为50min；(k)水洗透析离心完成后，取沉淀，装入半透膜中。将半透膜放入超纯水中进行透析，以去除沉淀中的盐离子。透析在 的低温下进行，每15min换一次水，整个透析过程持续3-4h；(l)冷冻干燥透析过程结束后，将沉淀放入冷冻干燥机，进行冷冻干燥12h，冻成的粉末状固体中含有所要提取的蚓多酶。硫酸铵沉淀法的具体流程如图2.2。-20静置1h4倍66%酒精调pH7.2加4倍水，调pH7.2冻蚯蚓闪提1min离心15min闪提1min沉淀超声30min-70冷冻12h融化-4，离心50min上清加入(NH4)2SO4固体至80%饱和度-4，离心50min沉淀水洗，透析 冷冻干燥蚓多酶图 2.2 硫酸铵沉淀法流程图2.2.4 实验方法三 乙醇乙醚双脱水法这种提取方法是将低温离心得到的上清进行乙醇乙醚的双脱水，自然风干后得到的粉末即所要提取的含有多种地龙活性蛋白的蚓多酶。具体步骤如下：蚓多酶的分离提取(a)剪碎首先称量一定质量的冻蚯蚓，加入体积分数为66%的酒精，其体积为冻蚯蚓质量的4倍。酒精逐渐加入，加入之后将块状的冻蚯蚓剪碎，避免硬块状的冻蚯蚓存在；(b)闪提将酒精和冻蚯蚓混匀之后，用闪式提取器连续提取1分钟，闪式提取器电压调至110V；(c)离心闪提结束之后进行离心，离心的注意事项是倒入各个离心容器中的悬浊液配平要准确，以免离心失败。该次离心使用的是低速离心机，离心的条件是5000r/min，时间15min，使沉淀与上清分离；(d)闪提离心之后，取沉淀，加入蒸馏水，其体积为冻蚯蚓质量的4倍。用pH计调节悬浊液的pH为7.2，然后用闪式提取器进行闪提。闪提的时间为1min，电压调至110V；(e)超声闪提之后，悬浊液的pH会有一定程度的下降，再用pH计将悬浊液的pH调为7.2，放入恒温超声提取机进行超声提取，温度设置在38，超声提取时间设置为30min，超声功率为800W，超声间隙时间0.3s，工作时间0.7s；(f)冷冻超声结束后，立即将悬浊液装瓶，放入-70的低温冰箱进行冷冻，冷冻时间为12h；(g)融化冷冻12h之后，从-70的低温冰箱中将悬浊液取出，进行常温水浴融化，至瓶中无冷冻形成的硬块；(h)低温离心融化完成后，将悬浊液进行高速低温离心。使用高速低温离心机的注意事项时进行严格的配平。离心的条件是温度为-4，转速为11000r/min，时间为50min；(i)加入冻酒精低温离心完成后，取上清液，测量上清液体积。然后加入体积分数为75%的在-20条件下保存的酒精溶液，体积为冻蚯蚓质量的3倍，然后再-20条件下静置1h；(j)低温离心静置1h之后，将溶液进行高速低温离心。使用高速低温离心机的注意事项时进行严格的配平。离心的条件是温度为-4，转速为11000r/min，时间为50min；(k)乙醇乙醚双脱水高速低温离心结束后，取沉淀，先加入适量无水乙醇，在普通离心机上进行离心，离心转速为5000r/min，时间为15min；离心结束后再取沉淀，加入乙醚，再次在普通离心机上进行离心，离心转速为5000r/min，时间为15min；(l)自然风干乙醇乙醚双脱水法的具体流程如图2.3。-20静置1h4倍66%酒精调pH7.2加4倍水，调pH7.2冻蚯蚓闪提1min离心15min闪提1min沉淀超声30min-70冷冻12h融化-4，离心50min上清加入3倍75%的冻酒精-4，离心50min沉淀无水乙醇、乙醚脱水 自然风干蚓多酶图 2.3 乙醇乙醚脱水法流程图2.3地龙提取物中蛋白质含量的测定2.3.1检测原理考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量，属于染料结合法的一种，是测定蛋白质含量的比较常用的方法，实验结果表明该方法准确、可靠、简便、灵敏度高。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm处；当它与蛋白质结合后变为青色，所得到的蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，即光吸收的值与蛋白质浓度成正比，因此可用通过测定染料在595nm处光吸收的增加量来得到蛋白质的含量。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内可反应完全并且达到平衡，完成反应十分迅速，且不需要严格的时间控制；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，且反应的干扰物质少，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0-1000g/mL，最小可测2.5g/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质含量的快速检测方法。2.3.2考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的具体步骤如下：(a)考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 体积分数为95%的乙醇中，加入100mL 质量浓度为85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤；(b)按照表3.1所示的浓度与体积配制标准蛋白质溶液；表 2.1 标准蛋白质溶液的配制试管编号123456标准牛血清蛋白(0.1mg/mL)0.00.20.40.60.81.0蒸馏水(mL)1.00.80.60.40.20.0考马斯亮蓝(mL)5.05.05.05.05.05.0(c)用分光光度计测定各浓度的标准蛋白质溶液加入考马斯亮蓝后在595nm处的吸光度；(d)以蛋白质含量(mg)为横坐标，吸光度(Abs)为纵坐标，绘制标准曲线，并计算标准曲线拟合方程和拟合度；(e)取待测样品，稀释若干倍至1mL，加入5mL考马斯亮蓝溶液，在595nm处测定吸光度，代入标准曲线计算样品蛋白质含量；2.3.3地龙提取物中蛋白质含量的测定(1)干燥所得的蚓多酶粉末中蛋白质含量的测定步骤如下：(a)称取若干质量的蚓多酶粉末，溶于水中，并稀释适当倍数；(b)加入考马斯亮蓝溶液5mL，在595nm处测定其吸光度；(c)代入标准曲线，计算该溶液中蛋白质含量；(d)由该溶液中蛋白质的含量计算得到的蚓多酶粉末中的蛋白质含量；(2)低温离心得到的上清中蛋白质含量的测定步骤如下：(a)吸取上清25L，蒸馏水975L；即将上清稀释40倍；(b)加入考马斯亮蓝溶液5mL，在595nm处测定其吸光度；(c)代入标准曲线，计算上清中蛋白质含量；2.4 单因素试验设计为了优化提取条件，包括闪提时间、固液比和pH值的优化，需要做正交试验；为了给正交试验做准备，提供合理的数据范围，必须先做单因素试验；每一组单因素试验采取相同的实验流程，具体的实验条件如表2.2所示。实验流程具体如下：(a)剪碎首先称量一定质量的冻蚯蚓，加入体积分数为66%的酒精，其体积为冻蚯蚓质量的4倍。酒精逐渐加入，加入之后将块状的冻蚯蚓剪碎，避免硬块状的冻蚯蚓存在；(b)闪提将酒精和冻蚯蚓混匀之后，用闪式提取器连续提取1分钟，闪式提取器电压调至110V；(c)离心闪提结束之后进行离心，离心的注意事项是倒入各个离心容器中的悬浊液配平要准确，以免离心失败。该次离心使用的是低速离心机，离心的条件是5000r/min，时间15min，使沉淀与上清分离；(d)闪提离心之后，取沉淀，加入蒸馏水，其体积依据每次单因素试验的具体固液比计算出来。用pH计调节悬浊液的pH为单因素试验的具体pH值，然后用闪式提取器进行闪提。闪提的时间为每次单因素试验的具体时间值，电压调至110V；(e)超声闪提之后，悬浊液的pH会有一定程度的下降，再用pH计将悬浊液的pH调为单因素试验的具体pH值，放入恒温超声提取机进行超声提取，温度设置在38，超声提取时间设置为30min，超声功率为800W，超声间隙时间0.3s，工作时间0.7s；(f)冷冻超声结束后，立即将悬浊液装瓶，放入-70的低温冰箱进行冷冻，冷冻时间为12h；(g)融化冷冻12h之后，从-70的低温冰箱中将悬浊液取出，进行常温水浴融化，至瓶中无冷冻形成的硬块；(h)低温离心融化完成后，将悬浊液进行高速低温离心。使用高速低温离心机的注意事项时进行严格的配平。离心的条件是温度为-4，转速为11000r/min，时间为50min；(i)测量蛋白质含量低温离心完成后，取上清液，测量上清液体积，然后按照2.3.2中叙述的考马斯亮蓝法实验步骤测定上清中的蛋白质含量；(j)烘干测量干燥的、未倒入上清液的培养皿质量，记为m1。然后取一定体积的上清液，倒入培养皿中，放入DZF-6050型真空干燥箱，温度调至68，真空干燥12h，待上清液干燥成为固体后，再次测量培养皿与固体整体的质量m2。提取流程所收得的干粉质量m由以下公式计算得到： m=m2-m1 (2.2)计用于干燥的上清体积为V1，上清总体积为V2，所用冻蚯蚓的质量记为m3，则提取流程的湿收率P1由以下公式计算得到： P1=V2V1mm3 (2.3) 干收率P2由以下公式计算得到： P2=P1P (2.4) 其中蚯蚓含水量P由公式(2.1)得到。单因素试验的具体流程如图2.4。4倍66%酒精调pH加水，调pH冻蚯