基于兔耳窗实验研究拉伸载荷对血管新生的影响

单位代码 10006 学 号 10101044 分类号 Q6 毕业设计(论文)基于兔耳窗实验研究拉伸载荷对血管新生的影响 学院名称生物与医学工程学院 专业名称生物医学工程 学生姓名晏 洋 指导教师赵 峰2014年6月基于兔耳窗实验研究拉伸载荷对血管新生的影响 晏 洋 北京航空航天大学北京航空航天大学本科毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目： 基于兔耳窗实验研究拉伸载荷对血管新生的影响 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求： 血管新生对力学环境的响应研究对创伤组织的血管重建和工程化培养组织的血管生成都具有重要的研究意义。本课题拟在经典的微血管观察实验兔耳窗实验的基础上，设计特殊的兔耳窗，对兔耳窗部位施加拉伸载荷，观测血管的新生并探索力学环境对血管新生的影响。目前已对相关研究有较全面的调研，对兔耳窗实验技术进行了一些预实验，已经对兔耳窗及其加载装置有初步的设计方案，研究条件具备。 、毕业设计（论文）工作内容：1. 文献调研，完成开题报告； 2. 兔耳窗的设计与加工； 3. 兔耳窗中新生血管观测实验； 4. 可施加拉伸载荷的兔耳窗的研制； 5. 拉伸载荷和无载荷条件下兔耳窗中血管新生的对照实验； 6. 新生血管的对比分析; 7. 实验结果整理，论文撰写。 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 页 、主要参考资料：1 Fukumura Dai, Window Models.in Microvascular Research, Ed. by David Shepro, Elsevier, 2006. Chapter 24, 151-157; 2 Tomizawa Y, Suzuki Y, etal, Macroscopic Sequential Pictures of Angiogenesis in a Rabbit Ear Chamber. Journal of Investigative Surgery,2002; 15: 269-274； 3 Komori K, Tomizawa Y, etal, A Single Local Application of Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor Accelerates Initial Angiogenesis During Wound Healing in Rabbit Ear Chamber. Anesth Analg, 2005; 100: 830-834; 4 Ichioka S,Shibata M,Effects of Shear Stress on Wound-Healing Angiogenesis in the Rabbit Ear Chamber. J Surgical Research, 1997; 72: 2935; 5 Matlaga BF, Salthouse TN, The rabbit ear chamber: a unique in vivo model for the continuous observation of implanted biomaterialsBiomat Med Dev Art Org, 1976; 4: 359-366. 院（系） 生物与医学工程学院 专业类 生物医学工程 班学生毕业设计（论文）时间： 自 年 月 日至 年 月 日答辩时间： 年 月 日 成绩指导教师：兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）：教研室主任注：任务书应该附在已完成的毕业设计（论文）的首页。本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。 作者：晏 洋签字：时间：2014年 6月北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 IV 页 基于兔耳窗实验研究拉伸载荷对血管新生的影响 学 生：晏 洋 指导教师：赵 峰摘 要大量的文献报道并证实了力学载荷对新生血管形成的重要影响。这些研究中大部份集中在血管内血流产生的剪切应力对新生血管形成的影响，而血管周围力学载荷对新生血管形成的研究相对较少。在传统的兔耳窗新生血管形成过程中，几乎可近似地认为血管仅受到血管内的血流动力学作用，受到外部组织的整体力学载荷为零。为了研究力学载荷对新生血管的影响，本课题基于兔耳窗技术，设计加工出一种新型兔耳窗装置植入兔耳，获取施加拉伸载荷力学环境下血管新生的图像，初步分析拉伸载荷对新生血管的影响。本文根据盖片材料的不同将兔耳窗分为三组，分别是云母盖片、硅胶盖片、拉伸硅胶盖片。不同兔耳窗按照相同的手术操作植入兔耳内。在手术后的第3、7、10、13、15天分别进行活体显微镜观察，拍摄血管图像进行图像处理分析。通过实验，我们在本实验室建立了一套基于兔耳窗技术研究新生血管的实验方法。我们也初步尝试了施加拉伸载荷研究新生血管的实验。同时我们还探索了新生血管的定量分析方法，用血管相对面积来定量分析新生血管。最后我们得到了一些结果：1）云母盖片组的血管新生要早于硅胶盖片组和拉伸硅胶盖片组，但在第7天三组均有新生血管出现；2）在兔耳窗组织愈合过程中，新生血管形成是一个初期增多，晚期减少的过程，在第7、10、13、15天，血管相对面积无显著性差异。关键词：兔耳窗、拉伸载荷、血管新生The study of tensile loads effects on angiogenesis based on rabbit ears chamber experimentAuthor : Yuan ZhenTutor : Zhao FengAbstractA large number of reports and confirmed a significant influence on the mechanical load on neovascularization. Most of these studies focus on the effects of shear stress in blood flow resulting in the formation of new blood vessels, and blood vessels around the relatively few studies on the mechanical load neovascularization. In traditional window rabbit ears during angiogenesis, can be approximately considered almost only by the hemodynamic effects of vascular vessels within the tissue affected by the overall external mechanical load is zero. To study the effect of mechanical load on angiogenesis, mechanical environment under tensile loads image angiogenesis rabbit ears on the topic window technique is applied to design a new type of processing device implantation window rabbit ears rabbit ears, acquisition, preliminary analysis of the tensile load effect on angiogenesis.To study the effect of mechanical load on angiogenesis, mechanical environment under tensile loads image angiogenesis rabbit ears on the topic window technique is applied to design a new type of processing device implantation window rabbit ears rabbit ears, acquisition, preliminary analysis of the tensile load effect on angiogenesis. Different rabbit ears in the same window operative implantation rabbit ears. In the first day after the operation were 3、7、10、13、15 vivo microscopy, the blood vessel image captured image processing and analysis.Through experiments, we have established the laboratory experimental method based on a set of rabbit ears Window technology research neovascularization. We also tried the experiment initial tensile load is applied research neovascularization. We also explored the quantitative analysis of new blood vessels, with a quantitative analysis of the blood vessels to the relative size neovascularization. Finally we got some results: 1) the mica group angiogenesis cover sheet to the cover sheet prior to silicone silicone group and stretched cover sheet groups, but the three groups at 7 days there were neovascularization; 2) a window in the rabbit ear tissue healing process, an initial neovascularization is increased, reducing the process advanced, at 7,10,13,15 days, the relative area of blood vessels was no significant difference.Key words：The rabbit ear chamber, tensile loads, angiogenesis北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 VI 页 目 录1绪论11.1新生血管及其形成11.2影响血管新生的因素21.2.1血管内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPC)21.2.2成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)31.2.3血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)31.2.4血小板衍生性生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)31.2.5一氧化氮(Nitrogen monoxidum，NO)31.2.6血管生成素(Angiopoietin，Ang)31.2.7力学载荷(Mechanical load，ML)41.3力学环境对新生血管的影响41.4新生血管形成的研究方法61.4本文的立题思路和研究意义81.4.1立题思路81.4.2研究意义91.4.3研究思路92兔耳窗的设计及植入实验112.1兔耳窗的设计112.2兔耳窗的植入实验122.2.1实验分组122.2.2兔耳窗的植入132.3实验后兔子的饲养162.4小结162.5讨论163新生血管图像的采集和分析183.1耳窗的愈合183.2活体显微镜观察183.2新生血管图像的采集203.3新生血管图像的分析223.3小结233.4讨论243.4.1 兔耳窗的改进243.4.1 手术方案的完善243.4.1 图像采集技术243.4.1 图像处理方法的改进253.5 进一步工作展望254结论26致谢27参考文献28附录33北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 34 页 1绪论新生血管形成在很多疾病中起关键性作用，例如血管的过度生成引起的癌症、动脉粥样硬化、慢性炎症和糖尿病性视网膜病变等1,2，以及血管的形成不足引起的心肌梗死后的结疤和慢性伤口愈合失败3。而新兴的组织工程面临的一个重大难题就是如何在体外形成三维血管网为工程化组织（器官）提供血供，此即组织工程的再血管化难题4等。因此，新生血管形成一直是多个生物和医学领域的研究热点和难题之一，研究人员力图阐明新生血管形成过程、机制和寻求促进/抑制新生血管形成的策略。窗口模式一般允许长期持续或反复观察，因而非常适合对生理和病理活动时间过程的研究5。窗口模式最适用于活体显微镜检查以及适合研究血管生成、微循环、肿瘤和工程化组织生长，疾病过程和治疗反应。兔耳密布着丰富的毛细血管网，是研究血管新生的良好平台。在兔耳上的窗口模式即兔耳窗能为新生血管的研究提供方便。生理机制调节血管生成还没有在活体上得到充分的研究。为此，本课题拟在经典的微血管观察实验兔耳窗实验的基础上，设计特殊的兔耳窗，对兔耳窗部位施加拉伸载荷，活体显微镜检查观测血管的新生并探索力学环境对血管新生的影响，从而建立一套研究方法，初步分析力学环境对新生血管形成的影响。1.1新生血管及其形成血管生长包括两个概念。第一是胚胎期的血管发生(vasculogenesis，VG)，第二是出生后的血管新生(angiogenesis，AG)。VG指的是在没有血管系统的情况下，由血管内皮祖细胞(endothelial progenitor，cells，EPCs)或成血管细胞(angioblasts)分化成内皮细胞，同时形成血管网。一般来说，它是以造血干细胞(HSC)为中心、EPCs在周围的血岛开始6。AG是一个极为复杂的病理生理过程，主要是内皮细胞从已有的血管处以出芽和套叠的方式直接生长而成7,8。在内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF) 等生化因子的调控8和力学载荷的刺激下，已有的毛细血管内皮肿胀、分裂、增生，形成实质性的内皮细胞条索(芽)，向外延伸，在毛细血管内血流的冲击下，条索逐渐出现管腔，形成再生的毛细血管，而后经一系列过程形成相应的血管平滑肌及外膜8。 （A）血管发生；（B）血管新生；（C）血管发生和血管新生图1.1 血管生长91.2影响血管新生的因素1.2.1血管内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPC)血管内皮祖细胞在出生后的机体内定居于骨髓和血液循环中。它是一群具有游走特征的、能进一步增殖分化的幼稚内皮细胞，是血管内皮的前体细胞，亦称血管母细胞，虽缺乏成熟内皮细胞的特征性表型而不能形成管腔样结构，但其参与胚胎期的血管发育，在成年的血管新生中也起着重要的作用10,11。1.2.2成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)FGF能够促进血管内皮细胞增殖、迁移、形成管腔，有较强的血管生成作用。大剂量的FGF促进动脉粥样硬化的形成，血管内膜过度增厚；小剂量的FGF仅对内皮细胞产生有益影响。另外FGF能够使VEGF表达上调12。1.2.3血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)VEGF是由两个相同多肽链以二硫键组成的二聚体糖蛋白，通过三种酪氨酸激酶受体：受体l(Fltl)、受体2(KDR/Flkl)和受体3(Flk4)高效、特异地作用于血管内皮细胞，促使血管内膜再生及血管通透性增加13。VEGF可以促进缺血区侧枝的建立，增加缺血组织的血供，改善其功能11。1.2.4血小板衍生性生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)PDGF是间充质来源细胞如成纤维细胞、平滑肌细胞等的有丝分裂原，具有促血管再生作用。除血小板d颗粒外，许多双倍体细胞如内皮细胞、血管平滑肌细胞等均可分泌PDGF。PDGF能拮抗低氧所致的培养人脐静脉内皮细胞增生能力的下降，剂量越大，效果越明显14。1.2.5一氧化氮(Nitrogen monoxidum，NO)NO是一种无机小分子，普遍存在于脊柱动物的各种细胞中，参与调节细胞问的信息传递、介导细胞免疫，对血管、神经系统和免疫功能等起重要的调节作用9。一般来说，NO可通过触发血管活性物质调节血管生长，调节血管的口径和流量，对肉芽组织的新生血管提供充足的血供，有利于新生血管的生长15。1.2.6血管生成素(Angiopoietin，Ang)Ang有四种同分异构体，分别是Ang1、Ang2、Ang3和Ang4。临床应用最广泛的是Ang1。Ang的受体是带有免疫球蛋白和表皮生长因子同源结构域的酪氨酸激酶(Tie)。酪氨酸激酶又包括受体1(Tie1)和受体2(Tie2)。所有Ang的同分异构体，均为Tie2的配体。Ang1诱导Tie2磷酸化，使内皮细胞出芽形成正常的血管树枝状结构，维持血管结构的完整性和稳定性，吸引血管周围细胞包围、支持内皮细胞重塑、成熟，促进局部侧支循环的建立。Ang2则抑制Ang1的作用16。1.2.7力学载荷(Mechanical load，ML)有研究表明，力学载荷在新生血管形成过程中起做重要的调控作用17-19。新生血管形成不仅受到全身代谢因子和血管所处微环境的调控7,20，力学载荷也是其中的重要调控因素。血管受到显著的力学作用，力学载荷来源于内皮细胞本身、胞外基质的反作用、血流和周围组织的作用21,22。血流产生的流体动力学载荷来自于血管内血液的流动和脉动的血压，可表征为血管壁的切应力和周向应力23,24，血管纵向血压以及血管与周围组织的作用可用沿血管的纵向张应力表征25,26。血管应力的持续动态变化，将不断地改变血管的结构和形态，这就是血管重建27；而当血管在胚胎发育、血管损伤等生理和病理情况下，血管在力学载荷及其它因子的调控下，会出芽或套叠形成新的血管，此即新生血管形成7,28。另外新生血管形成过程中内皮细胞的迁移、腔管的形成、平滑肌细胞的迁移等都明显受力转导机制的控制29。1.3力学环境对新生血管的影响目前，已有大量的文献报道并证实了力学载荷对新生血管形成的重要影响。这些研究中大部份集中在血管内血流产生的剪切应力对新生血管形成的影响30，而血管周围力学载荷对新生血管形成的研究相对较少。这些研究主要集中在对骨折愈合过程、骨骼肌的过载训练、组织工程支架材料的再血管化等方面的研究。力学环境对骨折部位的新生血管形成一直受到关注。固定和血供是影响骨折愈合的两大关键因素，固定为骨折断端提供适当的局部力学环境，血供的重建主要依靠新生血管的形成从而为骨折部位的愈合提供氧气和营养，这是大家很早就达成的共识。而力学环境对于新生血管的调控作用，也逐渐得到研究者的关注，如Claes L 等对绵羊跖骨截骨模型的研究表明骨愈合过程中早期新生血管密度受骨固定的稳定度29和骨断端的间隙31的影响；Lienau J 等的研究也表明骨折端的机械稳定保证了微血管的再生32；Choi IH 等研究了骨折端的微动及牵张成骨对血管的再生及骨折愈合的促进作用33；Miclau T 等研究发现骨折固定的稳定性明显影响骨折处间充质细胞血管新生因子的表达34。另一研究力学刺激对新生血管形成影响较多的组织是骨骼肌。骨骼肌的收缩或拉张，会直接作用在肌肉组织中的血管上，刺激新生血管的形成。如Hoier B 等研究了运动训练时人体骨骼肌中的剪切应力和被动张力将诱导肌纤维囊泡中的血管内皮生长因子释放并促进毛细血管的形成17；Egginton S 对老鼠伸趾长肌拉伸过载研究了肌肉血流与生长因子及毛细血管形成的关系，发现增加血流并不能促进初始毛细血管床的形成，而拉伸则刺激毛细血管清蛋白表面或上调内皮细胞血管生成因子（ESAF）从而刺激毛细血管生长35；Pufe T 等的研究表明肌腱滑移区域无血管的维持和发展可能是因为力学原因诱导了血管新生抑制因子的更高表达36。近年来，力学环境刺激组织工程材料的再血管化的研究越来越受到重视。组织工程的一个关键性难题就是组织支架材料的再血管化，从而为体外工程化培养组织提供血供。力学载荷对体外培养的内皮细胞等作用，将促进或抑制血管的形成。如Gould RA 等了组织三维培养下周期各向异性应变对于血管间质细胞表型和组织重建的影响，发现增加双轴应变各向异性将增加波形蛋白和平滑肌动蛋白的表达，并促进细胞的增殖和凋亡，而周期应变将降低波形蛋白和平滑肌动蛋白的表达17；Wilson CJ 等的研究也发现在周期应变将破坏人工基质中内皮细胞网的形成37。力学环境对其它新生血管形成模型中血管形成的影响研究相对较少。如Baker AB 等用特制的力学载荷装置拉伸小鸡绒毛尿囊膜观测新生血管形成，发现拉伸载荷将显著地增加新生血管的数量38。Ichioka S 等用兔耳窗研究了血管剪应力对伤口再生的影响，发现慢性血管舒张导致的血管剪应力增大将刺激毛细血管的形成，增大毛细血管的密度39。Baker AB 认为，血管的整体响应有可能与体外内皮细胞的响应相似40。在剪切力作用下细胞骨架变形，胞外基质的蛋白网变形和离子通道打开，将使得内皮细胞变形并沿力线方向排列39。Tranqui L 等提出，离体新生血管形成试验表明纤维蛋白凝胶基质与细胞牵引力的耦合作用将触发生物凝胶形成预图式，进而诱导细胞形成毛细血管状结构网络41。这样，胞外基质的力学环境将诱导和确定新生血管的形成方向42。在力学载荷的作用下，胞外基质的纤维成分拉伸并将沿力线排列，而胞外基质的非均匀性将诱导细胞沿载荷方向排列生长。 这些研究表明环境对新生血管形成有着显著的调控作用17-19。通过文献我们可以知道，目前的研究主要集中在两个方面：一是力学环境对于血管数量和密度的直接影响，另一是力学环境作为始动因素对于促进或抑制新生血管形成的生长因子和细胞因子等的调控。但骨折部位的力学环境非常复杂而难于准确地观测和定量分析新生血管所受到的力学载荷. 赵峰等最近用血管灌注micro-CT 成像技术在骨折愈合过程中的对该问题进行了探索，发现骨折固定的牢稳程度对血管的形成图式有显著影响20,21。赵峰等的一些动物实验显示，新生血管不仅在密度上对力学环境产生响应，我、而且在形成的几何形态图式上有着更明显的响应，比如血管密度的分布图式、新生血管的发生时间与随时间的演化图式、血管的分支和方向分布图式、血管分布的维数等。我们知道，微血管网络形态图式的研究有着重要的生理和病理意义。连接微动脉和微静脉之间的微血管网是血管与周围组织之间进行物质交换的场所，它的基本功能是在向各器官组织输运氧气和营养物质，携走代谢产物，调节组织的内环境稳定。1.4新生血管形成的研究方法血管新生指的在成体血管上由已经存在的成熟内皮细胞冲破管壁基质后迁移，增殖和重构，以发芽的方式使血管分支持续延长生成新的毛细血管。AG通常发生在胚胎生长、伤口愈合、运动训练等生理病理情况下43。对于新生血管形成，传统的研究方法主要有免疫组织化技术、原位杂交技术、血管灌注Micro-CT成像技术。这几种研究方法都各有优缺点。如免疫组化技术具有特异性强、敏感性高、定位准确等几大优点，缺点是过程复杂且没法再活体上进行。同样，在研究DNA分子复制原理的基础上发展起来的原位杂交技术的优点是具有很高的敏感性和特异性，可以在分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制，常用来评估调控血管生成的重要生长因子的表达模式44，缺点依然是过程复杂且没法再活体上进行。近年来，随着计算机生物医学成像技术的快速发展，逐渐建立的血管灌注Micro-CT成像技术为血管特别是微血管系统的三维几何重建提供了一个行之有效的研究方案，这项技术能够很精细地重建骨折愈合部位新生血管的发生和演化过程。Micro-CT成像技术最大的缺点是造影剂对实验动物造成的致死伤害。换句话说，Micro-CT成像技术对血管新生的研究是不连续的。目前有种造影剂在动物体内可以及时被代谢掉，但价格昂贵。另外，在使用Micro-CT机时会对实验人员造成一定的身体损伤。对新生血管形成的研究已经建立了一系列的在体和离体模型45,46，如角膜血管新生模型、 鸡胚尿囊膜（Chorioallantoic membrane）血管生长模型、斑马鱼实验模型、兔耳窗模型47,48等。在这些模型中，最突出的是兔耳窗模型。1924 年，Sandison 研究发明了第一个用在兔子耳朵内植入的透明观测窗，为在体研究细胞和组织行为提供了一种显微观测技术47。从那时起，这种模式的各种改进版本就被广泛应用于微循环形态研究和各种药物对哺乳动物组织的不良作用等。在Sandison的第一篇论文中，他阐明了三种类型耳窗的设计原则：两个专门的窗子，一个为再生组织设计，一个为预成型组织设计；一个双用途的的窗子包含了预成型和再生组织。他觉得这三种类型的窗子不仅通用且效率高。但是这些类型的窗子安装比较困难因此没有得到大范围的适用。随后Clark (1954),、Williams(1954)、Curri 和Tischendorf (1953,1954)在论文中描述了一系列不同的设计修改和它们的一些应用。现在兔耳窗技术已经是是新生血管形成的经典在体观测模型之一。Williams RG 曾对兔耳窗的原料和结构进行过较详细的研究，认为钽（Tantalum）和云母片（做透明板用）是制作兔耳窗的最理想材料48。Clarke 等应用免耳窗观察了组织工程材料的再血管化的过程49。兔耳窗能清晰地在体区分新生血管，并在显微观测下可实现微米级的毛细血管结构重现，且由于其血管生长区域仅50 微米厚，几乎可以看成是二维的结构。这为新生血管的观察以及定量研究提供了极大的便利。耳窗模式有很多优点，比如兔耳窗是在动物身上的长期模式，并发症如脱落或感染的发生概率较低，可以在不麻醉或按压动物的情况下进行日常的拍照，并且不需要打开窗子就能进行定期观察，可以连续观察正在生长的血管肉芽组织以及正在生长的血管。兔耳窗的一些缺点也被指出，主要的问题是由于大多数耳窗是由透明的反射材料例如玻璃、丙烯酸树脂或云母制成，导致兔耳窗中毛细血管宏观照片的质量并不令人满意。通常不加处理而获得的图像对比度不高、边缘不清晰并且存在耀斑。1.4本文的立题思路和研究意义1.4.1立题思路整体上来说，目前对于力学环境对新生血管形成的影响的研究越来越受到关注，但仍处于探索阶段，对于其机制的理解还相当的有限。这些研究中，力学载荷对新生血管形成的影响主要体现在两个方面，一是力学环境对于血管数量和密度的直接影响，另一是力学环境作为始动因素对于促进或抑制新生血管形成的生长因子和细胞因子等的调控。不同的力学环境对于新生血管的形成有着不同的促进或抑制作用。对于力学环境影响新生血管形成的机制尚不清楚，而对于现象的研究也仅限于骨折愈合部位的研究20,21。但由于骨折愈合过程中对新生血管的研究尚未能很好地解决两个主要问题：1）骨折部位的力学环境非常复杂，人体或实验动物的术后活动很难控制，难于准确地观测和定量分析新生血管所受到的力学载荷，从而很难定量地评估力学刺激；2) 欲重建骨折愈合过程中的血管图式形成，目前效果较好就是血管灌注Micro-CT 成像方法，可这种方法需在不同愈合时间处死大鼠，不能活体成像血管的三维结构，不能准确地把新生的血管从原有血管中区分出来。生理机制调节血管生成还没有在活体上得到充分的研究。本文拟采用经典的兔耳窗新生血管形成观测技术25,26，在高倍显微镜的在体观测下，更精细地观测、区分和重现新生血管。在传统的兔耳窗新生血管形成过程中，几乎可近似地认为血管仅受到血管内的血流动力学作用，受到外部组织的整体力学载荷为零。为了研究力学载荷对新生血管的影响，本课题在兔耳窗技术的基础上，设计加工出一种新型兔耳窗植入兔耳后，活体显微镜观察血管新生，从而建立一套研究方法。再设计一种可施加载荷的新型兔耳窗，精准地控制力学外载荷和精细地观测新生血管的成过程，更深入地定量研究科学问题：力学载荷如何影响新生血管的形成。1.4.2研究意义本课题拟研制一种新型的可施加力学载荷的兔耳窗装置，以实现对兔耳窗中新生血管附着生长的基底进行加载。同时，建立新生血管的形成定量描述指标体系，定量探索不同力学加载下兔耳窗中血管形成影响。本课题的成功研究，将为进一步的新生血管形成的机制研究提供现象描述和定量数据基础，为一些生理和病理难题的解决提供思路，为临床骨折的治疗、皮肤修复和组织工程材料中再血管化的力学配置等提供理论支持。1.4.3研究思路本课题是在进行充分的文献调研的基础上开始的，研究内容主要包括：首先，前期主要是在文献调研的基础上用不同材料对兔耳窗进行设计。其次是动物实验部分，主要是兔耳窗的植入实验和实验后兔子的饲养。再接着在确定的时间对兔耳窗进行活体显微镜观察，利用一个耦合到数位式彩色摄像机moticam 2000的Motic AE34倒置显微镜来观察耳窗内微血管，对新生血管图像进行采集。最后通过Mathworks公司的Matlab R2012a软件对获取得到的图像进行分析处理。 图1.2兔耳窗装置植入手术流程图2兔耳窗的设计及植入实验要探究拉伸载荷对血管新生的影响，首先要建立兔耳窗模型，为后期新生血管图像的获取提供条件。本节将详细叙述兔耳窗的设计、兔耳窗的安装实验和兔子的饲养等方面的细节和注意事项。2.1兔耳窗的设计耳窗装置由以下部分组成：1）基板:厚1mm，直径为24mm的塑料圆板。基板的周边部有三个外穿小孔（直径2mm），用来固定窗子。基板中心部位用打孔器扩出一个直径约为15mm的外穿大孔，简称中心孔。在活体显微镜观察时中心孔可以透光，有助于成像。2）盖片：与基板形状相同的透明云母片和硅胶片。盖片周围有与两基板相对应的3个外穿小孔。盖片直接与耳朵两侧的软骨组织相接触。3）盖板：和基板相同，厚1mm，直径为24mm的塑料圆板。盖板的周边部也有三个相对应的外穿小孔（直径2mm），盖板中心部位也有用打孔器扩出的直径约为15mm的中心孔。4）垫圈：外径4mm，内径3mm，厚0.3mm的硅胶圆环。垫圈穿过螺丝放在盖片和耳朵之间，用来以增加盖片与耳朵组织之间的空隙，使免耳窗装置置入后不影血液循环，有利于耳窗内组织的生长。5)直径1mm的螺丝3个，相应螺丝帽3个。 图2.1 耳窗的组成部分：（a）基板；（b）盖板；（c ）盖片；（d）垫圈；（e）螺丝和螺母图2.2 安装好的耳窗装置2.2兔耳窗的植入实验2.2.1实验分组本实验用到的动物是体重2.02.5kg的日本大耳白兔（购于北京大学医学部实验动物部）。兔子购买回来后，首先进行适应性喂养3-5天，待兔子熟悉饲养环境，情绪稳定后即可进行耳窗安装手术。分别用不同材料（云母和硅胶）的盖片组装好兔耳窗。硅胶拉伸产生形变可对预成型组织产生外加力学载荷。本课题中硅胶的拉伸形变为10%。表2.1 实验分组23456显微镜检查时间3天 7天 10天13天 15天云母盖片5只5只4只3只2只硅胶盖片3只3只2只1只1只拉伸硅胶盖片3只3只2只1只1只2.2.2兔耳窗的植入实验用品及手术器械：1%的戊巴比妥钠溶液、生理盐水、青霉素钠、止血棉、注射器、打孔器、眼科剪、摄子、剪刀、钳子、铁丝、铁链、塑料扎带和兔子固定箱等。手术步骤：1）麻醉。小心地把兔子放在一个专门定制的固定箱中，限制它的活动并安抚兔子，待其安静不挣扎时即可麻醉。麻醉前用沾有酒精的棉花擦拭右耳耳沿静脉，使血管充盈变粗从而利于进针注射麻醉剂。在右耳耳沿静脉上用3%戊巴比妥钠溶液麻醉（剂量为30-35mg/kg）。麻醉后剃去耳朵两侧的兔毛，消毒耳部皮肤。2）选择耳廓近末梢的部位开窗。在欲开窗相应部位用打孔器穿过软骨和皮肤打出三个直径为2.5mm的外穿孔。外穿孔的尺寸和位置以匹配圆盘和周边柱脚为基准，用来固定耳窗。打孔时尽量选择没有大血管的部位，切勿伤及较大的血管。3）在耳廓内面，三个小外穿孔的中央部位，用打孔器打出一个直径为5mm的外穿孔，为中央孔。用眼科剪小心地切开并剥离外穿孔周围一圈的皮肤(表皮与真皮)，剥离的宽度为2mm左右。暴露出真皮下的软骨。4）安装。暴露出皮下软骨要后迅速安装耳窗装置。将基板安置在耳郭内面，盖片和耳窗环固定于耳廓的外面。在3个小孔处安装螺丝。置入耳窗置前，喷洒青霉素。置入耳窗装置后，在其周围涂以消炎软膏。5）固定四肢。兔耳窗装置安装好后，用塑料扎带绑好兔子的四肢，再用细软铁丝分别将前肢和后肢的两个扎带串绑好。前肢铁丝长度为15-18cm，后肢铁丝的长度要略大于前肢，为18-20cm。这么做的目的是防止在组织愈合过程中兔子由于瘙痒或者疼痛而用后/前肢拍打耳朵，从而保护耳窗装置。图2.3耳沿静脉注射麻醉剂图2.4剥离表皮和真皮，暴露皮下软骨 图2.5植入兔耳的耳窗装置2.3实验后兔子的饲养兔耳窗安装好后，兔子尚未清醒，小心地将其放在兔笼中。在水槽中放好清水，食槽中放好兔粮，待其醒来饮食。兔笼的大小以兔子能在其内自由转身为适。兔粮购于北京大学医学部实验动物部。兔子在温控室内恒温饲养，每天早中晚各换水一次，喂食一次，每次喂食不宜过多。喂食量可以在最开始由两次喂食之间兔子吃下的饲料量来定。一般来说，晚上较早晨和中午应多喂食。每天早晚各打扫一次兔笼卫生。兔笼应保持干燥并及时清理兔子身上掉落的兔毛，处理兔子排出的粪便，保证兔笼干净卫生。每次活体显微镜观察时，抓兔子的动作尽量轻柔。一来可以防止对兔子产生惊吓，二来可以避免对兔子造成不必要的伤害。用手抓住兔子的后背将其从兔笼中提出，小心地用另一只手拖住兔子的后肢，形成一个抱的姿势安抚它直到其平静不挣扎。2.4小结本节首先论述了兔耳窗的详细设计，介绍了实验分组，以及详细描述了将不同材料盖片组成的兔耳窗装置植入到兔耳内的动物实验手术。最后介绍了有关兔子在实验手术后的饲养。2.5讨论耳窗植入手术是活体显微镜观察新生血管之前的重要环节。因此需要实验者在手术前熟悉一些外科手术相关的知识。在手术时如果损伤组织较重，挤压、挫伤血管，都可能会影响微血管的功能及恢复。无菌操作不严密，从而造成炎症反应，也会妨碍实验的进行。所以，所有操作都必须在无菌环境下进行。在术中微血管损伤可出现以下三种情况：1）出血。剥离表皮和真皮时，可能会损伤穿过软骨的23条小血管，从而造成耳窗内积血，影响后期的活体显微镜的观察。2）微血管受到挤压。这种情况可能是手术中一时性压迫，也可能是是安装耳窗装置过紧所致。3）损伤血管壁。这种损伤大多是肉眼不可见的损伤。血管收缩时受损处膨大，使血管呈念珠状。因此，手术时操作必须仔细，轻柔，尽量避免机械性挤压。另外在麻醉时，注射麻醉剂的速度一定要适当，不能太快也不能太慢。在本课题的进行中，第一只兔子就不幸被麻醉致死。在请教老师、查找相关文献近一周后才发现是由于在麻醉时进药过快导致的。这么一耽搁严重影响了试验进度。通过后来的实验摸索，探究得出使用3%的戊巴比妥钠麻醉兔子，最佳的剂量是30-35mg/kg，最佳的进药速度是0.1ml/s。兔子是一种很温顺的动物。虽然有一种说法“兔子急了还咬人”，但是要意识到兔子是不会轻易“急”的。所以在做有关兔子的动物实验时，第一想法不是要想怎么防止被兔子咬，而是应该想怎么抓兔子才不会对它身体造成损伤。传统的抓法如拎兔耳、抓兔颈在一定程度上都会对兔子身体造成损伤。特别是本项目需要研究兔子耳朵上的新生血管，对兔子耳朵的保护应该更加得到重视。3新生血管图像的采集和分析术后从第7天到第15天，每2天用一个耦合到数位式彩色摄像机moticam 2000的Motic AE34倒置显微镜来观察耳窗内微血管。耳窗内组织的透照是在一个150瓦的卤素投影灯（飞利浦）协助下完成的。3.1耳窗的愈合 在我们的实验中，耳窗的愈合无没有产生并发症，并且预成型组织的生命力表现得很好。组织生长发生在总体空间的中央薄层上。通常在手术完的后几天观察不到有明显的血管生长。中央孔和盖片的缝隙间充满着伤口分泌的组织液。随着组织适应了新的环境和封闭的表面，软骨膜结缔组织层也逐渐变得更加透明。在大多数情况下，耳窗内有着毛细血管床的组织生存时间较长，这样就为短时间及长时间的观察提供了可能性。3.2活体显微镜观察活体显微镜检查法是一种功能强大的光学成像技术，它可以非侵入性的监测完好活体组织内的分子和细胞过程，分辨率达到了1-10毫米。复杂的动物模型，如窗口模式是这一技术的先决条件。在研究中，动物一般四肢展开绑好，仰卧放置在固定板上。毋庸置疑的是，虽然动物可以通过训练使自己适应这样的固定方式，但是真这样的话就不可避地引入了应力因素。而且仰卧姿势在生理学上说很难长时间保持。为了消除这些潜在的误差来源，我们在观察的时候使兔子以正常的姿势蹲伏在一固定箱中。同时它整个的背面与颈背颈部都用带子绑好并支撑好头部。固定没有造成耳朵产生任何压缩或扭曲