细胞培养的生长条件和细胞培养室.ppt

课程回顾和思考,上皮型细胞,扁平，形态较为规整，细胞大致呈多角形，胞体近中央处有扁圆的细胞核；细胞之间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列；当细胞紧密排列时,细胞可为六角形或多角形，因为相互拥挤而呈现“铺路石样”，局部可构成单层的上皮样“膜片组织”,成纤维型细胞,细胞呈梭形、长条形、多角形或不规则形，后两种情况下常具宽扁胞质突起(片状伪足)；胞质近中央处有椭圆形胞核，胞体一般铺展很开。多数情况下，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。有时也见相互平行排列，成群细胞呈现放射状、漩涡状等走行形式,游走型细胞,细胞相互分,一般不形成群落；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒，常具有胞质突起(伪足)。这类细胞在培养器皿壁上生长的位置不固定，经常处于较活跃的变形及游走状态，因此外形不规则且不断变化。,多形型细胞,多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，但它不像成纤维细胞型的细胞那样，不规则形态由宽扁的胞质突起所致。其细胞一般分胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样不规则。,体外培养细胞的整个生命活动过程分期,每一代细胞的生长过程分期,第四讲 动物细胞体外培养的生长条件和培养设备,一、所需营养,营养条件是细胞体外生长的基本条件。 在培养液中，除了细胞生命活动所需的各种营养物质之外，还必须提供调节细胞生长与功能活动的激素、生长因子以及生长基质成分等。,1、氨基酸,蛋白质合成的原料 12种必须氨基酸 谷氨酰胺（每种细胞都需要） 作用：（1）促进氨基酸进入细胞膜； （2）为嘌呤和嘧啶提供氮来源 ； （3）合成三、二、一磷酸腺苷所 必需原料 注意：-20保存谷氨酰胺，42周就会失效,2、碳水化合物,能量来源 六碳糖（葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖） 葡萄糖最适合细胞吸收 半乳糖最难被细胞吸收,3、无机盐,Na+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-、HCO3等无机离子 作用：1、维持细胞渗透压； 2、调节细胞膜功能； 3、是合成维生素、激素和酶的原料,4、维生素,细胞生长必不可少 大多做为辅酶、辅基 分为脂溶性和水溶性两种 脂溶：A、D、E、K 水溶：B族和C族（精米精面与五谷杂粮） 血清能提供维生素，但是还需再添加一些其他维生素,5、促生长因子和激素,传递各种信息 调节细胞代谢 保持细胞状态 促进细胞增殖 来源：血清 培养基中基本都会添加5%-20%的小牛血清,6、其他成分,微量元素：铁、锌、硒 ； 铜、锰、钒 现有的文献并没有明确规定要加入，或许加入的非限定物血清中含有。 促细胞贴附物质：对悬浮型细胞无效 并非必需 但有促进作用 一些其他物质：丙酮酸钠 2-巯基乙醇 2-巯基乙醇（2-Me）：含巯基，能将含S化合物还原成谷胱甘肽,诱导细胞增殖 避免过氧化物损害细胞 介导DNA合成,2-Me,谷胱甘肽,抗氧化剂和自由基清除剂，还能调节其他氧化剂； 谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸三者结合而成； 解毒：能和芥子气、铅、汞、砷等重金属盐络合，达到整合解毒,二、培养细胞的生存环境,（一）、温度 1.生理温度范围 温度能够影响体内细胞代谢活动。在生理温度范围内，温度越高，酶活性越高,细胞代谢越快。 大多数动物细胞在2535范围内都仍然能够生存和生长。若将培养细胞放在4下，数小时后再放回37,细胞仍然能够继续生长。,体外培养动物细胞最常用的温度是37。培养的细胞总的来说对较低温度的耐受能力比较高温度(一般不超过39)的强。高于生理温度阈值时，温度越高，对细胞损伤越大。,培养的细胞处在3940下1h，即会受到一定的损伤，但仍然可以恢复；在4142下lh，细胞便会受到严重损伤，绝大多数细胞将死亡；当培养温度高达43时，1h内将使得全部细胞死亡。 高温对细胞造成的损伤程度与暴露的时间长短也有关。,2.高温的影响,(1)高温破坏了细胞内的酶 (2)高温能破坏细胞膜上的脂类 (3)高温影响细胞分裂,生物体耐受高温原因,(1)酶的变化 (2)与原先的生活环境温度有关 (3)与脂类物质的熔点有关 (4)营养状况,3.低温的影响,培养细胞对低温的耐受力较之对高温的耐受力要强。在生理温度范围内，温度越低，酶活性越低。当温度降至细胞所能忍受的最低限度时，细胞的生命活动即会受到抑制。,低温条件能使细胞的核分裂时间延长。 低温条件还能使细胞的代谢活动降低 不同细胞能够忍受的低温阈值不同，能够忍受低温环境的时间长短不同。 低温条件能造成一定的细胞死亡。,（二）、气相环境对细胞生长的影响,培养细胞的气相环境尤其是2和2对细胞生长也很有影响。2参与细胞的能量代谢过程，而2对维持培养液的酸碱度很重要。 体外培养的气相条件主要决定于培养物的类型、培养液的类型、培养系统(开放式或密闭式系统)以及需要的缓冲能力等因素。细胞培养与器官培养的气相环境差别较大。,对于绝大多数开放式培养系统来讲，动物细胞培养的气相环境都是采用5%CO2与95%空气的混合气体。个别类细胞生长需要有别于此的气相条件。,气相环境必须维持一定的2浓度用以保持培养液的pH值。应该记住，培养液中的HCO3-2缓冲对是大多数细胞培养液的基本条件，如果培养箱中没有2供应时，培养系统必须保持密闭。,（三）、培养用水,机体内的水分为自由水和结合水 能促进细胞吸收营养 也是生化反应所需介质 去离子水 蒸馏水 双蒸水 三蒸水,（四）、培养液的酸碱度对细胞生长的影响,大多数的有机体细胞能在pH6.08.0的环境中生存。最适宜的pH值范围是7.27.4。植物细胞通常适宜pH5.66.0。 培养的细胞若处于过酸或过碱的环境中，同样会发生酸中毒或碱中毒。,体外培养的正常细胞耐酸能力要强于耐碱能力。 发生恶变的细胞常常比正常细胞能忍受更广的pH值范围。 继代培养的细胞忍受酸碱度变化的能力略强于原代培养的细胞。 有机酸对细胞的损害比无机酸要大，一般的顺序是：硫酸或盐酸磷酸枸橼酸乳酸醋酸。 酸碱度可以影响各种弱酸进出细胞。,在酸性环境中生长时，H可使H2C03以分子的形式进入细胞，并在细胞内进行分解而使得细胞内酸化。相反，当在碱性环境中生长时，H2C03可以从细胞内出来，与培养液中的碱结合，形成重碳酸盐。,五、辐射线对细胞生长的影响,能够对体外培养的细胞生长产生影响的辐射线包括可见光、紫外线、X射线、射线以及射线等类型。 1.可见光 多数结果表明光线能够促使培养的细胞发生退化 不同波长的光线对细胞生长的作用有所不同。 不同细胞对于光线照射的反应不一。,2.紫外线,紫外线能够影响细胞的生命活动，对细胞生长造成破坏 不同波长的紫外线对细胞造成的伤害程度不同，波长越短的紫外线损伤越严重。 不同细胞对紫外线的敏感性是不同的。 紫外线对细胞生长的影响主要在于能破坏细胞的遗传物质和蛋白质结构。,3.X射线、射线与射线,不同类型的细胞对这几种放射线的反应是不同的，反应也因射线剂量与细胞生长条件而有所不同。 低剂量时将缓慢降低细胞的增生率，高剂量将对培养细胞产生致死效应。 X射线、射线与射线对培养细胞造成的影响相似。主要是通过引起染色体发生畸变而致细胞分裂活动发生异常或受到抑制。超过一定剂量，引起细胞死亡。 射线对细胞生命活动的影响在体外培养工作中也有有益的应用,六、超声波对细胞生长的影响,超声波对培养的细胞一般会产生破坏作用，强度稍大时，会造成细胞破裂。 超声波所致细胞破裂的时间少于11200s 超声波主要是通过空化作用而引起细胞死亡的。 另外，超声的机械作用、热学作用以及化学作用等，都能对细胞产生很大影响。 不同的细胞对超声波的敏感性不同。,七、影响细胞生长的其它因素,1.橡胶的毒性作用 而一般普通的橡胶对细胞都是有毒的。 热碱与热酸煮沸处理，其实也不能明显降低其毒性作用 如果用乙醚或者乙醚、丙酮和乙醇联合处理能够较好地降低橡胶制品的毒性作用。 一般来说，纯橡胶与硅胶的毒性较低。黑橡胶的毒性较强。,2.离心处理的影响,离心力越大，对细胞造成的伤害越大。普通离心比密度梯度离心所造成的伤害要大。 在普通离心时，习惯使用低于1000r/min的转速，离心时间常用510min。 离心处理对生命力脆弱的细胞(如神经元)的伤害要比生命力旺盛的细胞(如肿瘤细