药物定量分析与分析方法验证课件_1

02:52:50,第 四 章,药物的含量测定方法与验证,02:52:50,02:52:50,第一节 定量分析方法的分类与特点,一、容量分析法,二、光谱分析法,三、色谱分析法,02:52:50,一、容量分析法,(一) 特点与适用范围 (1) 方法简便易行 (2) 方法耐用性高 (3) 测定结果准确 (4) 方法专属性差 适用于原料药含量测定,(二) 有关计算: 1. 滴定度与滴定度计算 2. 含量计算 (1) 直接滴定法 (2) 间接滴定法 生成物滴定法 剩余量滴定法,将已知浓度滴定液滴加至被测药物溶液中,至滴定终点,根据滴定液的浓度,体积和滴定度,计算含量 .,02:52:50,结果计算,1、滴定度的计算 aA+bB=cC+dD; cC+eE=fF+gG; 滴定反应 fF+hH=iI+lL aA hH,m:滴定剂摩尔浓度；M被测物摩尔质量；a/h:反应摩尔比,02:52:50,2. 含量测定,直接滴定法,生成物滴定法,剩余量滴定法,(1),(2),(3),02:52:50,(1) 直接滴定法,注意掌握滴定反应的原理, 药物与滴定剂在反应中的摩尔比 正确计算滴定度和百分含量,02:52:50,(2) 生成物滴定法,注意摩尔比的替换,药物与A作用生成B, 用滴定液滴定B,百分含量计算方法与直接滴定法相同,02:52:50,（3）回滴定（剩余滴定）,（a）不做空白试验时百分含量计算 （b）做空白试验时百分含量计算,02:52:50,司可巴比妥钠含量测定: 本品约0.1g, 加水10ml溶解, 精密加溴滴定液(0.05mol/L)25ml, 再加盐酸5ml, 放置15分钟, 加碘化钾试液10ml, 用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定, 滴定的结果用空白试验校正,W=0.1022g; 硫代硫酸钠滴定液 F=1.038; 供试品消耗硫代硫酸钠滴定液15.73ml;空白23.21ml,02:52:50,滴定度,司可巴比妥钠M=260.27, 与溴摩尔比为1:1,02:52:50,二、光谱分析法,定义,分类,UV-Vis,利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法光谱分析法,IR,AA,Fluor,FP (flame photometry),02:52:50,三、色谱分析法,特点与应用,分类,依据分离原理：,(1) 高灵敏度:ng-g/ml (2) 高专属性:选择性检测 (3) 高效能与高速度,吸附;分配;离子交换; 分子排阻色谱法,复方制剂含量测定的首选方法,依据分离方式：,纸色谱;薄层色谱;柱色谱; 气相色谱;高效液相色谱法,02:52:50,第二节 样品分析的前处理方法,(一) 水解法; (二) 还原法,(一) 干法破坏; (二) 湿法破坏,02:52:50,进行药物定量分析之前，一般都需要对样品进行前处理。 根据待测元素在药物分子中结合的牢固程度，前处理方法各异。 在分析含金属或含卤素、氮、硫、磷等元素的有机药物前，需进行适当的样品前处理。,02:52:50,含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐。,02:52:50,一、不经有机破坏的方法,1.酸水解法 水难溶性含金属有机药物与矿酸(盐酸)共热:,回流 有机结合的待测元素原子离解, 转化为无机盐(离子),2. 碱水解法 含卤素有机药物(脂肪碳链)与氢氧化钠溶液回流:,适用于: 结合不牢固的 含金属或含卤素有机药物,(一) 水解法,02:52:50,碘他拉酸测定:氢氧化钠试液与锌粉回流后, 用硝酸银滴定,回流 碱性溶液中加锌粉回流, 使碳-碘键还原转化为无机碘化物,碘番酸 胆影酸 胆影葡胺注射液 泛影酸 泛影酸钠 泛影葡胺注射液,适用于: 结合牢固的含碘有机药物 (直接与芳环连接),(二) 还原法,02:52:50,常见的含卤素有机药物,三氯叔丁醇,六氯对二甲苯,02:52:50,泛影酸,02:52:50,胆影酸,02:52:50,碘他拉酸,02:52:50,碘番酸,02:52:50,碘苯酯,盐酸胺碘酮,02:52:50,诺氟沙星,02:52:50,醋酸氟轻松,02:52:50,磺溴酞钠,02:52:50,含卤素有机药物的分析,直接回流后测定法,碱性或酸性还原后测定法,氧瓶燃烧分解后测定法,02:52:50,有机金属药物：金属原子直接与碳原子以共价键相连，结合比较牢固 如卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利,02:52:50,酒石酸锑钾,02:52:50,硬脂酸镁,富马酸亚铁,02:52:50,葡萄糖酸锑钠,02:52:50,卡巴胂,醋酸苯汞,02:52:50,汞撒利,02:52:50,二、经有机破坏的方法,(一) 湿法破坏 适用于含氮有机药物分析的前处理 硫酸作为分解剂, 氧化剂(硝酸,高氯酸)辅助分解剂 凯氏定氮法,(二) 干法破坏 高温炽灼法 用于含卤素药物的鉴别 无水碳酸钠,硝酸镁,氢氧化钙,氧化锌等辅助灰化 2. 氧瓶燃烧法,适用于: 含金属, 卤素, 氮, 硫, 磷等 有机药物 (待测原子与碳原子结合牢固者),02:52:50,1. 高温炽灼法 高温灼烧灰化 用于含卤素药物的鉴别 2. 氧瓶燃烧法,02:52:50,（1） 氧瓶燃烧法原理,氧瓶燃烧法：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定。,02:52:50,适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析。,本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析。,02:52:50,（ 2） 仪器与材料,仪器装置 燃烧瓶为500、1000或2000ml无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状,02:52:50,称样用材料及称样,A. 固体样品 无灰滤纸,B. 液体样品 纸袋,C. 软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹,02:52:50,氧气,吸收液,A. 作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态,02:52:50,B. 吸收液的选择,氟 水 氯 NaOH溶液 溴 H2O2-NaOH NaOH-硫酸肼饱和溶液 碘 NaOH硫酸肼饱和溶液 硫 NaOH或H2O2 硒 硝酸溶液,02:52:50,（3）操作方法,燃烧瓶燃烧前的准备,用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气1min，立即用表面皿覆盖瓶口。,样品的准备,取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。,02:52:50,样品的燃烧,点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，待燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。,02:52:50,根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。,ChP（2005）规定的燃烧瓶体积为500、1000或2000ml三种，采用常量或半微量分析,注意事项：,02:52:50,02:52:50,正确选用燃烧瓶的目的在于：样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。,02:52:50,测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶,铂丝燃烧时起催化作用,应同时做空白试验,燃烧时要注意防爆,燃烧要完全,燃烧产生的烟雾完全被吸收,02:52:50,应用,例 磺溴酞钠的含量测定 ChP (2005),02:52:50,02:52:50,含金属的有机药物：金属原子不与碳原子直接相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物 如酒石酸锑钾、葡萄糖酸锑钠、富马酸亚铁,02:52:50,需验证的项目,验证的内容,准确度,定量限,防腐剂 溶出度,释放度,鉴别试验,杂质检查,含量测定,第三节 药品质量标准分析方法验证,精密度,专属性,检测限,线性,范围,耐用性,重复性 中间精密度 重现性,02:52:50,一、准确度（accuracy）： 测量值与真实值接近的程度 表 示: 回收率 测定方法：回收试验 加样回收试验,02:52:50,（一）含量测定方法的准确度 1、原料药,回收试验：,空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M,02:52:50,加样回收试验：,已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,02:52:50,原料药 （1）可用已知纯度的对照品或样品进行测定 （2）用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。,02:52:50,2、 制剂 （1）用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法。,（2）如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定。 （3）另一个已建立准确度的方法比较结果。,02:52:50,02:52:50,中药 分析的准确度一般用加样回收试验衡量。 中药回收率一般要求在95105%范围内，有些方法操作步骤繁多时，可要求在90110%范围内。RSD一般在3%以内。,02:52:50,（二）杂质定量测定的准确度,（1）可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。 （2）如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较。,02:52:50,（三）数据要求,规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。,02:52:50,二、精密度,1.重复性 同一分析人员连续测定所得结果的精密度; 也称批内精密度或日内精密度,2.中间精密度 不同时间不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度 批/日间精密度,3.重现性 在不同实验室不同人员测定结果之间的精密度 法定标准采用的分析方法进行,同一均匀供试品多次取样测定所得 结果之间的接近程度 标准偏差(s,SD);相对标准偏差(RSD) 数据要求同“准确度”,定义,02:52:50,偏差（d）：测量值与平均值之差,标准（偏）差（SD或S）:,02:52:50,三、专属性（specificity）:,指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性)。,02:52:50,(一) 鉴别反应 空白, 结构相似物或有关物质呈负反应,(二) 含量与杂质测定 含杂质或降解产物的试样中各峰能获得分离,在其他成分(杂质,降解产物,辅料等)可能 存在下,方法能正确测定出被测物的特性 鉴别,杂质检查和含量测定方法,定义 与应用,02:52:50,四、 检测限（limit of detection， LOD）： 药物能被检出的最低浓度(g/ml) 测 定: 信噪比法(S:N=3:1),02:52:50,适用于可用目视法直接评价结果的 分析方法, 非仪器分析法 鉴别的显色法;杂质检查的TLC,适用于能直观显示信号与基线噪声 水平的分析方法, 如HPLC法 信噪比S/N=3(2)时的相应浓度或量,适用于不能直观比较信噪比的仪器 分析方法, 如UV-Vis法,常用方法,1.目视法,2.信噪比法,3.标准偏差法,02:52:50,五、定量限,杂质和降解产物用定量方法研究时, 应确定LOQ,LOQ的测定方法与LOD相同 相应的系数(倍数)不同, 如信噪比S/N=10,定量限(limit of quantitation, LOQ )是指试样中被测物能被定量测定的最低量;,02:52:50,六、线性,范围系指方法适用的高低限浓度或量的区间 在试验研究开始前确定验证的范围和方法 在范围内应能达到一定精密度,准确度和线性,线性系指在设计的“范围”内, 响应值(y)与被测物浓度(x)直接呈正比关系的程度 y = ax + b 系列(n5)供试样品测定,以响应信号作为被测物浓度的函数作图 用最小二乘法进行线性回归; 或经数学转换后再进行线性回归,02:52:50,七、范围,原料药/制剂含量测定: 80%120% 制剂含量均匀度检查: 70%130% 溶出度或释放度检查: 下限-20%上限+20% 特殊元素含量测定: 下限-20%上限+20% 杂质测定: 限度20%,涉及定量测定的项目均需对范围进行验证 如: 含量测定, 含量均匀度, 溶出度或释放度, 特殊元素或特殊杂质的定量检查,02:52:50,八、耐用性,耐用性系指在测定条件有小的变动时, 测定结果不受影响的承受程度; 体现测定条件的允许变动范围 HPLC法典型因素有: 流动相的组成和pH值及流速, 不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱, 柱温等 GC法典型因素有: 不同厂牌或批号的色谱柱, 固定相, 不同类型的担体, 柱温, 进样口和检测器温度等,02:52:50,九、验证内容的选择,验证内容选择的一般原则: 非定量分析方法 如鉴别,杂质的限度检查法: 验证“专属性”,“检测限”和“耐用性” 定量分析方法 如原料药或制剂的含量测定及含量均匀度,溶出度或释放度的测定方法: 除“检测限”和“定量限”外, 其余均验证 微量定量分析方法 如杂质的定量测定方法: 除“检测限”视情况而定外, 其余均验证,02:52:50,检验项目和验证内容：, 已有重现性验证，不需验证中间精密度 如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充 视具体情