农残快速检测法生化法.ppt

1,湖南省农产品质检中心 李拥兵,蔬菜上农药残毒快速检测技术 （生化法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药）,2,速测法最低检出浓度,最高残留限量,引起中毒的残留浓度,低浓度,高浓度,仪器最低检出浓度,3,试剂,提取试剂 磷酸缓冲液(磷酸氢二钠+磷酸二氢钾) PH-8 胆碱酯酶 底物 碘化硫代乙酰胆碱 (ATCI) 碘化硫代丁酰胆碱 (BTCI) 显色剂 ：二硫代二硝基苯甲酸(DTNB),（乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶）,4,试剂的保存 酶：粉状的酶应保存在冷冻室内（约-18度），用时用缓冲液（提取液）溶解，溶解后的酶液分成2-4小瓶，暂时不用的储存在冷冻室内，用时解冻，解冻后的酶液贮存在冷藏室内（0-5度），酶液用后及时放回冰箱中冷藏，最好在一周内用完，反复解冻不能超过两次，否则会影响酶的活性 。 底物：固体及溶解后的底物均应保存在冷藏室内。 显色剂：固体及溶解后的显色剂均应保存在冷藏 室内（0-5度）。 提取试剂：固体及溶解后的缓冲液只需在常温下保存。 速测卡：未开封的速测卡可在常温干燥下保存半年，10下保存一年。每小包速测卡开封后须在三天内用完，应密封保存。,5,检测原理,在对农药残留的检测中，如果蔬菜的提取液中不含有有机磷和氨基甲酸酯类的农药残留或残留量较低，酶的活性就不会被抑制，试验中加入的基质就被酶水解或少部分水解，水解产物与加入的显色剂反应产生颜色。反之，如果蔬菜的提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试验中加入的基质就不能被酶水解，从而不显色或颜色变化很小，用分光光度计来测定反应前后吸光值的变化，计算出抑制率，就可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯农药的残毒情况。,6,反应方程式（以丁酰胆碱酯酶为例）,1、（CH3）3NCH2CH2SCC3H9,O,（硫代丁酰胆碱）,+,H2O,BchE,37-380C,（CH3）3NCH2CH2SH(硫代胆碱）+,C3H9COOH(丁酸）,2、,（CH3）3NCH2CH2SH(硫代胆碱）+,显色剂,黄色物质,底物,酶,7,生化法检测原理,酶 + 有机磷或氨基甲酸酯类农药 酶被抑制,酶 + 样本提取液,酶活被抑制,含有机磷或氨基甲酸酯 类农药,活性正常,不含有机磷类或氨基甲酸酯 类农药,酶 + 拟除虫菊酯类农药,酶活不被抑制,8,分光光度法 仪器, 分光光度计(RP-410或RP-420), 电子天平, 微型混合器, 培养箱, 移液枪, 取样器, 其他配件,9,检测过程,取2克样本（非叶菜取4克），切碎,加入20毫升提取试剂，震荡1-2分钟,倒出上清液，静置3-5分钟,试管或比色杯中加入 50微升酶、 3毫升样本提取液、 50微升显色剂 .,在37-38C下培养30分钟 .,于待测的5只试管或比色杯内加入50微升底物， 于412纳米波长下比色。,10,4,5,2,3,0,1,前,后,样品池5,样品池3,样品池1,样品池4,样品池2,0位池，调仪器状态，要空置,附1:RP-410型仪器样品室平面图：,11,吸光值 A1 A2 C S1 S2 S3 S4 抑制率 R1 R2 R3 R4,3分钟前吸光值,空白吸光值,样本吸光值,抑制率,附2：打印结果说明 （1）、检测1个空白、4个样本打印结果如下,3分钟后吸光值,12,吸光值 A1 A2 C S1 S2 S3 S4 S5 抑制率 R1 R2 R3 R4 R5,3分钟前吸光值,空白吸光值,样本吸光值,抑制率,3分钟后吸光值,（2）、检测5个样本打印结果如下,13,抑制率% = Inhibition%,C - S,C, 100%,抑制率% ： 酶被抑制的程度 C : 对照组3分钟前后吸光度值之差 S : 样本3分钟前后吸光度值之差 * 对照组的比色杯中用3毫升提取试剂代替样本提取液 .,结果计算,14,结果判定,抑制率70%（阴性）,合格,检测结果以抑制率（%）表示,抑制率70%（阳性）,根据市场管理 规定处理,用GC进一步 定性定量分析,至少要2次以上 重复检测确认,15,速测卡法 仪器设备及试剂, PR-3A农残速测仪, 电子天平,速测卡, 取样器, 其他配件,16,检测过程,取5克样本，剪碎，放入烧杯中，加入10毫升纯净水，搅动,接通电源，打开PR-3A农残速测仪，预热10分钟，使之达到 反应设定的温度（39）,将速测卡沿中线对折，揭去速测卡保护膜，插入速测卡（红色药片向上，白色药片置于加热器上），然后在白色药片上滴两滴提取液。,按“确认”，不要合盖，进入第一次反应倒计时。反应倒 计时进入一半时，根据提示检查是否需要加入提取液。 .,反应完毕，合盖进入显色反应。显色反应完毕后， 取出卡片，判读结果,17,结果判定,试纸显示蓝色,合格,以试纸显示颜色为判断标准,白色为阳性,根据市场管理 规定处理,用GC进一步 定性定量分析,至少要2次以上 重复检测确认,18,速测卡片法中注意事项 1、每批测定应设一个洗脱液或纯净水的空白对照卡，样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。 2、空白对照卡不变色的原因：一是药片表面缓冲液加得太少，预反应后的药片表面不够湿润；二是反应温度太低。 3、放置10分钟进行预反应，预反应后药片表面必须保持湿润。白色药片上水份不能蒸干，否则会出现假阳性。 4、红色药片和白色药片叠合反应的时间为3分钟。3分钟后蓝色会逐渐加深，24小时后颜色会逐渐褪去。 5、防止交叉感染。每个样品处理时所用的剪刀、玻棒和滴管要洁净；一个样品农药浓度过高，通过空气挥发到另一个样品上，有可能污染另一个样品；室外检测时，附近喷洒农药有可能会使测定药片不变蓝而出现假阳性。,19,讨 论 1 此方法适用于新鲜蔬菜和水果上的农残快速检测，但部分含特殊物质(S)的蔬菜如大葱，大蒜、韭菜等以及一些菌类如茭白、蘑菇等，易得出现假阳性结果。对含残留量愈高的蔬菜，测定的误差愈小。此法也不适于茶叶等干样样品。 2、此方法只能检测有机磷和氨基甲酸酯类农药，不适用于其他农药残毒检测，且不能定性和定量，所以，当用此方法检测出有残毒问题的蔬菜时，如果要作为仲裁处理，应送到有关部门进一步用气相色谱等仪器进行定性和定量分析,其结果方可作为最终结论性数据。 3、在有机磷和氨基甲酸酯类农药中，也有少部分农药品种对此方法不够灵敏(检出浓度30毫克/千克)。此酶对以下农药不敏感：甲基对硫磷、水胺硫磷、甲基异柳磷、毒死蜱、乐果 等。,20,4 假阳性产生的原因及解决办法 (1)酶试剂的活性降低 确认酶的活性，更换酶试剂。 (2) 蔬菜切得太碎，比色皿中的沉渣影响吸光值。 过滤或离心提取液 (3) 检测对象不适宜(如韭菜、萝卜、蘑菇等) 抽