黄果冷杉化学成分研究

毕业论文（设计）本 科 毕 业 论 文论文题目 云南黄果冷杉化学成分研究 专 业 中药学 云南黄果冷杉的活性成分研究目 录中文摘要2Abstract.2前言3第一章 冷杉化学成分和药理作用研究进展.51.1 化学成分.51.2 药理作用.10第二章 实验部分 132.2 仪器与实验材料.132.3 提取分离.13第三章 化合物的结构鉴定 14参考文献16致谢18附录.19云南黄果冷杉的活性成分研究摘要：目的：对松科植物冷杉Abies ernestii. var. salouenensis 中的化学成分进行系统的研究,为了解冷杉药理作用的物质基础，寻找新的活性成分以及进一步开发提供理论依据。方法：采用高浓度的乙醇提取，提取液浓缩加水混悬后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。采用硅胶、反相、凝胶、大孔树脂、MCI等现代色谱方法对其中的氯仿、乙酸乙酯部位进行系统的化学成分研究。通过 UV, MS, NMR等光谱方法确定其化学结构。结果：从中分离得到3个化合物，经确定分别为(+)-儿茶素、山柰酚、槲皮素。关键词：云南黄果冷杉；松科；黄酮类；抗肿瘤Studies on the chemical constituents of Abies ernestii. var. salouenensisAbstract：Objective: To carry out systematically the chemical constituents from Abies ernestii. var. Salouenensis, provide the theoretical basis for the material foundation of its pharmacological activities and search for the new active ingredients. Methods: The compounds were separated and purified by column chromatography on silica gel and Sephadex LH-20, and identified on the basis of physico-chemical properties and spectroscopic methods. Results: Three compounds were isolated and identified as (+)-catechin, kaempferol and quercetin.Keywords：Abies ernestii. var. salouenensis; Pinaceae; flavonoid; anti-tumor 前言冷杉属(Abies)是松科(Pinaceae)的一个重要属，大约有50种，分布于亚洲、北美、欧洲、中美及非洲北部的高山地带，中国有19种及3个变种。根据现代药理研究表明，该属植物具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗炎、抗溃疡、抗真菌、降压、镇咳、昆虫保幼以及中枢神经系统方面的一些活性1。由于冷杉属植物分部广泛并且具有良好的药理活性，从1938年至今，国内外许多研究者对该属植物开展了系统的化学成分研究，已经从冷杉属植物中分离鉴定了约400个化合物，结构类型主要为萜类、黄酮、木脂素以及酚类、甾体、脂肪酸等。虽然我国有着丰富的冷杉植物资源，但我国研究者仅从2006年才开始对中国产的7种冷杉属植物进行比较系统的研究，从中分离鉴定约100个化合物，其中不乏新型骨架的二萜、黄酮2-4。近年来，对冷杉属植物的药理活性研究主要集中在抗肿瘤活性方面。张卫东等研究长苞冷杉不同部位的药理活性8，发现其氯仿部位对A549(人肺癌细胞), LOVO(人结肠癌细胞), QGY-7703(人肝癌细胞)和6T-CEM(人T淋巴细胞白血病细胞)等肿瘤细胞株有较好的增殖抑制作用，通过进一步研究发现了大量抗肿瘤、抗炎的新化合物。其中从秦岭冷杉中分离出的三萜内酯类化合物Neoabieslactonee F、Neoabieslactonee E 对人体肿瘤细胞体外增殖具有较好的抑制作用，其IC50值与阳性对照阿霉素的相当。此外，对小鼠S180肉瘤(实体型)疗效实验有显著抑瘤作用，具有良好的临床应用价值。通过文献查阅，我们发现产自云南西北部及西藏东南部海拔2600-3200米地带的云南黄果冷杉(Abies ernestii. var. salouenensis)是中国特有的树种，而且资源丰富，但是并未见其化学成分和药理活性研究的相关报道。为了寻找结构新颖的抗肿瘤活性先导化合物，我们对云南黄果冷杉进行了初步的化学成分预实验和药理活性测试。研究结果发现，其醇提取物的氯仿萃取部位富含三萜类化合物，乙酸乙酯萃取部位富含二萜类化合物，初步的抗肿瘤活性实验显示2个萃取部位均有较好的抗肿瘤活性。值得一提的是，其氯仿部位活性优于乙酸乙酯部位。这与文献报道的其他种冷杉植物抗肿瘤活性实验结果有差别。因此，我们拟首次开展云南黄果冷杉的系统化学成分研究工作，填补国内外其化学研究工作的空白，进一步丰富冷杉属化学成分研究内涵，考察其中分离得到的单体化合物的抗肿瘤活性，以期明确其抗肿瘤活性的化学物质基础，为进一步深入开发利用该植物资源提供科学依据。根据植物形态学，松科分为冷杉亚科，松亚科和落叶松亚科。2000年Xiao-Quan Wang等通过细胞遗传学研究，提出云杉属应该从冷杉亚科中分出，作为一个单独的亚科。通过对冷杉属植物进行系统的植物化学研究，并与云杉属中的化合物进行比较，可以从植物化学分类学方面进一步确认该分类的合理性。云南黄果冷杉作为中国的特有树种，我们的化学成分研究工作对其分类学研究具有重要的科学意义。第一章 冷杉化学成分及药理作用研究进展1.1 化学成分研究对冷杉属植物的化学成分研究始于 20 世纪 40 年代，从冷杉属植物中已分离鉴定了大约 277 个化合物，化合物的类型主要为萜类，尤其是三萜。此外还包括黄酮，木脂素以及少数酚类、甾体、脂肪酸和脂肪醇等。而最新研究表明，香豆素、降二萜也广泛存在于冷杉中，进一步丰富了冷杉中化合物的种类。2008 年至今，文献又相继报导从冷杉中分离鉴定了大约100个化合物，其中不乏骨架新颖的倍半萜、黄酮1。1.1.1萜类 三萜类 三萜是冷杉中的一类主要成分。从冷杉中分离得到的三萜主要有两类：羊毛脂甾烷型(lanostane)和环阿尔廷烷型(cycloartane)。而近两年分离得到的三萜也都属于这两种类型，值得一提的是近两年从秦岭冷杉和库页冷杉种分离得到的三萜多为侧链为内酯环的三萜。到目前为止，已报道的三萜约有88个2。 二萜类 此前报导的二萜主要是松香烷型二萜(abietane)和劳单烷型二萜(labdane)，Kaneko等人还报道过从日本冷杉中得到的一个海松烷型二萜(pimarane)。最近两年发现的二萜类化合物主要来自于长苞冷杉和秦岭冷杉。 降二萜类 降二萜类化合物是杨献文等人首次从冷杉植物中分离得到的类型，此类化合物主要以松香烷型居多，其中又以降三碳(C-15, 16, 17)的podocarpenes居多，其次是降一碳(C16或C18)松香烷化合物。此外还有降二碳(C-14, 15)的劳丹烷型二萜3。 倍半萜类 到目前为止，倍半萜是分离得到的骨架类型最多的一类化合物，而这类化合物主要是挥发性成分。目前报道的倍半萜多为从主要类型有链状型(acyclic)，吉码烷型(germacrane)，蛇麻烷型(humulane)，雪松烷型(himachalane)，愈创木烷型(guaiane, dodecane)，没药烷型(bisabolane)，桉烷型(eudesmane)，杜松烷型(cadinane)。但是近两年报导的该类成分并不多。1.1.2黄酮类冷杉属植物分离得到的黄酮类化合物主要含黄酮，黄酮醇，查尔酮及其苷，主要来源于A. amabilis，A. pindrow。此外还首次发现C4-C4相连的双黄烷醇abiesanol A9。化合物1-46是从冷杉属植物中分离得到的53个黄酮类化合物。1-13为双黄烷醇类(diflavanols)，14-31是黄酮及黄酮苷类(flavones)；32-34为黄酮醇类(flavonols)； 35-41是二氢黄酮类(flavanones)；42-47为二氢黄酮醇及其苷类(flavanonols)；48-50是黄烷-3-醇类(flavan-3-ols)；51-53为查尔酮类(chalcones)。 R1 R2 4 H OH 5 OH H 6 OH OHR1 R2 R31 H OH H2 OH H H3 H OH OH R1 R2 7 H OH 8 OH H 9 H H 10 OH OH11 R=-OH12 R=-OH 18 R=H19 R= TPC TPC= 17 R= R1 R2 26 TPC CPC 27 CPC CPC 28 CPC TPC TPC= CPC= R1 R2 R320 H TPC H21 H H TPC22 TPC H TPC23 H TPC TPC24 H H caffeoylTPC= R1 R2 R3 R4 R5 R625 H H H H H H29 OMe H H OMe CH3 H30 OMe H H OMe CH3 OMe31 Glc OMe OMe OH H OH32 OH OH OH OH H H33 OH H H H H H34 OH OH H H H H R1 R240 H H41 OH H42 H OH43 OH OHR1 R2 R337 Glc O H H38 OH Glc H39 H OMe CH3R1 R2 R344 H H Glc 4745 H Glc H46 OH Glc H R1 R2 R348 OH -O H OH49 H -O H OH50 H -O H OH R1 R2 R351 H OMe OH52 CH3 OH OH53 H OH OMeTable 1 Flavonoids from Abies speciesNo.Compound class and nameSourcesRef1larixinolAbies chensiensis1223-epi-larixinolAbies chensiensis12313-HydroxylarixinolAbies georgei134Abiesinol AAbies sachalinensis145Abiesinol CAbies sachalinensis146Abiesinol GAbies sachalinensis147Abiesinol BAbies sachalinensis148Abiesinol DAbies sachalinensis149Abiesinol FAbies sachalinensis1410Abiesinol HAbies sachalinensis1411Abiesanol BAbies georgei1312Abiesanol AAbies georgei15133,2-epi-larixinolAbies chensiensis12145-hydroxy-6-methyl-7,4-dimethoxyavone-8-O-D-glucopyranosideAbies spectabilis1615isorhamnetin-3-D-(6-O-acetyl) glucosideAbies spectabilis1616JuglalinAbies spectabilis 1617kaempferol 3-O-(2-O-p-coumaroyl)- -L-arabinopyranosideAbies spectabilis1618AfzelinAbies chensiensis1219kaempferol-3-O-L-(2,4-di-E-p-coumaroyl)-rhamnosideAbies chensiensis 1220kaempferol-3-O-D-(3-E-p-coumaroyl)-glucopyranosideAbies chensiensis1221kaempferol-3-O-D-(6-E-p-coumaroyl)-glucopyranosideAbies chensiensis1222kaempferol 3-O-(3, 6-di-O-E-p-coumaroyl)-D-glucopyranosideAbies spectabilis1623kaempferol-3-O-D-(3,6-di-E-p-coumaroyl)- glucopyranosideAbies chensiensis1224kaempferol 3-O-(6-caffeoyl-glucoside)Abies georgei1325ApigeninAbies spectabilis1626stenopalustroside DAbies georgei1327stenopalustroside AAbies georgei1328stenopalustroside CAbies georgei13294,5-dihydroxy-3,7-dimethoxy-6-methylavoneAbies spectabilis16305-hydroxy-6-methyl-7,4-dimethoxyavoneAbies spectabilis 1631syringetin 3-O-D-glucopyranosideAbies georgei1332KaempferolAbies chensiensis1233AromadendrinAbies chensiensis1234MyricetinAbies spectabilis16352-hydroxynaringeninAbies spectabilis1636TsugafolinAbies chensiensis1237ChoerospondinAbies chensiensis1238PruninAbies chensiensis12395,4-dihydroxy-6-C-methyl-7-methoxy flavanoneAbies chensiensis1240NaringeninAbies chensiensis1241EriodictyolAbies chensiensis1242AromadendrinAbies chensiensis1243TaxifolinAbies chensiensis1244kaempferol-7-O-D-glucopyranosideAbies chensiensis1245kaempferol-3-O-D-glucopyranosideAbies chensiensis1246quercetin-3-O-D-glucopyranosideAbies chensiensis1247PallasiinAbies spectabilis1648(+)-catechinAbies chensiensis1249AfzelechinAbies chensiensis1250()-epiafzelechinAbies chensiensis1251GymnogrammeneAbies chensiensis12529,4-Dihydroxy-5,7-dimethoxy-8-methylchalconeAbies georgei13532,4-dihydroxy-4,6-dimethoxychalconeAbies georgei131.1.3木脂素 木脂素类化合物主要为二芳基丁烷类，二芳基丁内酯类，苯骈呋喃类，苯基四氢奈类。近两年从冷杉中分离的木质素主要是李永利等人从秦岭冷杉的乙酸乙酯部位中分离得到。1.1.4 酚类和其他类 酚类化合物也是冷杉中的一类常见物质。1.2 药理作用研究药理研究表明，冷杉属植物代谢产物具有广泛的生物活性，如昆虫保幼，抗肿瘤，抗菌，抗真菌，抗溃疡，抗炎，抗高血压，镇咳，中枢神经等作用。近两年来在对长苞冷杉粗提物的生物活性进行研究时发现氯仿部位主要表现为抗肿瘤作用，乙酸乙酯部位主要表现为抗炎作用 ，同时对抗炎机制也进行了一些研究，在对冷杉属所分离得到的化合物筛选时，也发现了一些具有生物活性的单体化合物。1.2.1 抗肿瘤活性 冷杉属植物代谢产物普遍具有抗肿瘤活性。其中Abies. Alba 和 Viscum album 的混合液对肿瘤细胞 L-1210 具有抗增殖作用；此外冷杉的氯仿提取物对LOVO 和QGY-7703 两种肿瘤细胞均有较强的抗增殖作用。A.koreana代谢产物24-Methylidene-3，4-secocycloart-4(28)-en-3-oic acid对肿瘤细胞A549，SK-OV-3，SK-MEL-2，和HCT-15具有广泛的细胞毒性作用。1.2.2 抗炎活性 冷杉的乙酸乙酯部位也表现出较强的抗炎活性，该提取物不仅能抑制 LPS 诱导的 NO 生成，而且能显著抑制TNF- 诱导的NF-B活性，有意思的是，该提取物还同时含有COX和LOX两种酶的抑制剂10。1.2.3 昆虫保幼活性1965年，Slama和Williams研究发现A.balsamea对欧洲昆虫Pyrrhocoris apterus具有此作用。已经分离得到的有效成分是juvabione11。1.2.4 抗菌活性大多数冷杉属植物的精油具有抗菌活性，其中A.alba和A.firma显示了适度的活性，而五种冷杉植物A.koreana，A.cilicica subsp.cilicica，A.cilicica subsp.isaurica，A.nordmanniana subsp.Nordmanniana， A.nordmanniana subsp.Bommaelleriana体外实验证明强有效的抗菌作用。最新研究发现，A.balsamea的精油中小分子-pinene，-caryophyllene，和-humulene具有抗金黄色葡萄球菌作用6。1.2.5 抗真菌活性冷杉植物A.sachalinensis的非极性成分对几种食用真菌的成长具有抑制作用。1.2.6 抗溃疡活性冷杉植物A.pindrow叶子提取物对小鼠胃溃疡模型具有显著疗效，另外一项阿司匹林诱导的大白鼠鼠模型实验中，该种植物的石油醚、苯、氯仿提取物具有保护作用7。1.2.7 抗高血压活性A.pindrow的石油醚提取物在狗实验中发现能够在心率和呼吸不变的情况下引起血压的暂时性的下降。但有学者认为可能是阿托品引起的。1.2.8 镇咳作用A.webbiana的甲醇提取物显示对SO2诱导的小鼠咳嗽模型的止咳作用具有量效关系的特点。实验表明此提取物具有和可待因相当的效果。另外一项实验表明其苯，丙酮，乙醇的提取物均对组胺引起的支气管痉挛具有支气管保护作用8。1.2.9 中枢神经活性A.pindrow提取物具有镇痛、催眠、镇静等作用。综上所述，冷杉化学成分较复杂，提取物及单体化合物具有多方面的药理作用，其复方在临床中的应用也较为广泛。随着对冷杉的深入研究,分离提取更多的活性成分，并通过现代药理学方法研究其作用机制，可以为进一步深入开发、合理利用该植物资源提供科学依据。因此，从冷杉中开发药物具有重要意义和美好的前景。第二章 实验部分2.1 仪器与材料熔点测定用XT4A型显微熔点测定仪（温度未校正），NMR测定用Bruker ACF-500 MHz或300 MHz核磁共振仪。柱层析及薄层层析硅胶均为青岛海洋化工厂产品。所用试剂均为分析纯，硅胶板为烟台市化学工业研究所生产；Sephadex LH-20为25-100 ，Pharmacia Fine Chemical Co. Ltd.生产。冷杉药材采购自云南，经中国药科大学生药学研究室濮社班教授鉴定为冷杉（Abies ernestii. var. salouenensis)。2.2 提取与分离 采用8倍量的80%乙醇加热回流提取3次，浓缩得浸膏，浸膏适当混悬于水中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。采用大孔树脂、MCI、硅胶、反相、凝胶等现代色谱方法对其中的氯仿、乙酸乙酯部位进行系统的化学成分研究。提取流程图：云南黄果冷杉 80% 乙醇提取 氯仿、乙酸乙酯萃取 氯仿部位 乙酸乙酯部位UV, MS, NMR等方法鉴定结构硅胶, SephadexLH-20, ODS, MCI,制备HPLC柱色谱分离纯化 Ab-2 Ab-3 Ab-4第三章 化合物的结构鉴定3.1结构解析3.1.1 Ab-1的结构鉴定Structure of Ab-1黄色粉末(甲醇)，mp 300 ，三氯化铝反应阳性，浓硫酸-香草醛显黄色，显示该化合物为黄酮类化合物，分子式为C15H10O6，分子量286， UV(MeOH) max: 265、365 nm。与山柰酚对照品在HPTLC中的Rf值及显色行为一致，故鉴定化合物Ab-1为3,5,7,4-四羟基黄酮，即山柰酚(kaempferol)，为首次从该植物中分离得到。3.1.2 Ab-2的结构鉴定Structure of Ab-2白色粉末(甲醇)，mp 175 177 ，浓硫酸-香草醛显红色。结合1H、13C NMR谱信息，推断分子式为C15H14O6，分子量290。1H NMR谱显示： 5.93 (1H, d, J = 2.4 Hz),5.86 (1H, d, J = 2.4 Hz)为A环质子信号，提示A环为5, 7-二取代； 6.84 (1H, d, J = 1.9 Hz)，6.76 ( 1H, d, J = 8.1 Hz)，6.72 (1H, dd, J = 1.8, 8.3 Hz)为一组1, 3, 4-三取代芳环质子的信号，提示B环可能为3, 4-取代。13C NMR谱共出现15个碳信号， 157.8、157.5、156.9、146.2、146.2为A、B环上的连氧烯碳信号， 132.3、120.0、116.1、115.3、100.9、96.4、95.5为A、B环上的烯碳信号， 82.9、68.8为两个连氧碳信号， 28.5为一个亚甲基碳信号。综合以上波谱数据并与文献1对照，确定化合物Ab-2为(+)-儿茶素(+)-catechin，为首次从该植物中分离得到。3.1.3 Ab-3的结构鉴定Structure of Ab-3黄色粉末(甲醇)，mp 300 ，三氯化铝反应阳性，浓硫酸-香草醛显黄色，显示该化合物为黄酮类化合物，分子式为C15H10O7，分子量302，UV(MeOH) max: 265、365 nm。与槲皮素对照品在HPTLC中的Rf值及显色行为一致，故鉴定化合物Ab-3为3,5,7,3,4-五羟基黄酮，即槲皮素(quercetin)，为首次从该植物中分离得到。3.2 化合物的理化常数及波谱数据3.2.1 Ab-1 山柰酚(kaempferol)黄色粉末(甲醇)，mp 300 ，三氯化铝反应阳性，浓硫酸-香草醛显黄色。分子式C15H10O6，分子量286， UV(MeOH) max: 265、365 nm。3.2.2 Ab-2 (+)-儿茶素(+)-catechin （见附录） 白色粉末(甲醇)，mp 175 177 ，浓硫酸-香草醛显红色，分子式C15H14O6，分子量290。1H NMR(CD3OD, 500 MHz) : 6.84 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2), 6.76 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-6), 6.72 (1H, dd, J = 1.8, 8.3 Hz, H-5), 5.93 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-6), 5.86 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-8), 4.56 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-2), 3.97 (1H, m, H-3), 2.85 (1H, dd, J = 5.5, 16.1 Hz, H-4), 2.51 (1H, dd, J = 8.1, 16.1 Hz, H-4)。13C NMR (CD3OD, 125 MHz) : 157.8 (C-9), 157.5 (C-5), 156.9 (C-7), 146.2 (C-4), 146.2 (C-3), 132.3 (C-1), 120.0 (C-6), 116.1 (C-5), 115.3 (C-2), 100.9 (C-10), 96.4 (C-6), 95.5 (C-8), 82.9 (C-2), 68.8 (C-3), 28.5 (C-4)。3.2.2 Ab-3槲皮素 (quercetin)黄色粉末(甲醇)，mp 300 ，三氯化铝反应阳性，浓硫酸-香草醛显黄色。分子式C15H10O7，分子量302， UV(MeOH) max: 265、365 nm。参考文献1 Yang, X. 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