铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达.doc

铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达【摘要】 目的 克隆铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体，为进一步研究这七种含Pilz结构域蛋白是否为第二信使c-di-GMP 潜在的受体分子奠定实验基础。方法 提取铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA, 用PCR方法从中扩增出七种功能未知的含Pilz结构域蛋白基因, 将其克隆到原核表达载体pET32a中, 在大肠杆 菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。结果 成功扩增出七种含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体, 测序结果与NCBI数据库收录序列相一致。SDS-PAGE检验证明目的基因在大肠杆菌BL21中获得高效表达。结论 从铜绿假单胞菌基因组中成功地克隆了七种含Pilz结构域蛋白基因，其构建的原核表达载体在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。 【关键词】 铜绿假单胞菌;c-di-GMP第二信使;Pilz结构域蛋白;基因克隆;原核表达载体构建铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa ), 又称绿脓杆菌, 是临床感染性疾病中常见的条件致病菌之一。该菌致病机制复杂而多样, 其固有的对抗生素和消毒剂的耐受性使治疗十分困难。铜绿假单胞菌全基因组测序的完成1, 特别是近几年环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)对细菌生物学功能调控作用的突破性研究进展, 使得我们在分子水平上深入探讨其耐药机理, 在信号途径的研究中寻找新的作用靶点成为了可能。作为一种广泛存在于细菌中的新型的第二信使, c-di-GMP 参与调控了多种细菌生物学功能，如细菌的运动性、生物膜合成、细菌毒性及细菌的群体感应等2，但其作用机制尚不完全清楚。铜绿假单胞菌全基因组共有5,670个基因, 利用生物信息学手段，在其全基因组中发现了八种编码Pilz结构域(Pfam07238)蛋白基因。与胞外多糖海藻酸钠合成有关的Alg44 (PA3542) 蛋白已被实验证明为c-di-GMP的受体分子, 其余七种蛋白功能未知。为了鉴定这七种含Pilz结构域蛋白是否为c-di-GMP 潜在的受体分子, 我们对其基因进行了克隆并尝试构建它们的原核表达载体, 旨在为今后铜绿假单胞菌基因-表型-致病性的体外研究以及c-di-GMP信号通路的深入研究提供实验材料。1 材料和方法1.1 材料 铜绿假单胞菌PAO1、pET32a 载体以及原核表达宿主菌BL21(DE3)由本室保存;蛋白酶K购自德国Merck公司; 限制性内切酶BamH1和Hind购自New England Biolabs公司;Pfu DNA聚合酶和T4 DNA 连接酶均购自Fermentas公司;IPTG为Sigma 公司产品。1.2 铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA的制备 铜绿假单胞菌标准株PAO1在LB琼脂平板上划线纯化, 挑取单克隆, 接种于15mL LB培养基中, 37C旋转培养过夜。3000g, 10 min离心收集细胞, TE(pH8.0)洗涤2次, 并重新悬浮于5 mL的TE缓冲液中, 加入250 L 20%SDS溶液, 轻轻地颠倒几次裂解细胞。然后加入50L的20 mgmL-1蛋白酶K, 37C作用1h。消化完成后, 加入等体积的Tris饱和酚, 轻轻混匀后于10000g离心10min, 取上清液。在同样的条件下用等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提后, 上清用2倍体积的异戊醇沉淀, 70%乙醇洗涤, 干燥后溶于100L TE中, -20C贮存备用。1.3 引物设计 根据这七种含Pilz结构域蛋白的基因序列,分别设计合成了七对特异性扩增引物,其中5端引物含有BamH1酶切位点,3端引物含有Hind酶切位点(表1)。表1 PCR引物序列注：F表示上游引物，R表示下游引物1.4 目的基因的扩增 以铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA为模板, 分别用各自的特异性引物扩增出它们完整的基因。PCR反应体系为50 L, 其中含1X PCR 缓冲液5 L, 10mM的dNTPs 1 L, 10 M 的5 端引物和3 端引物各1 L, 2.5UL-1的Pfu 聚合酶 1 L, 模板DNA 100ng 。PCR 扩增条件为：94C 预变性2 min;94C 变性30s, 54C 退火30s, 72C延伸2 min, 共30 个循环;最后72C 延伸5 min。反应结束后, 取5 L PCR 扩增产物, 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。1.5 表达质粒的构建及表达 将上述PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳回收。目的DNA片段及载体pET32a 分别用BamH1和Hind 双酶切, 按81的比例混合, 用T4 DNA连接酶16 C连接过夜。将构建的pET32a-Pilz载体, 分别转化E. coli Bl21 (DE3) 感受态细胞, 37C过夜培养, 随机挑取单个菌落接种于5 mL LB (含氨苄西林) 培养液, 37C 振荡培养细菌达A 600 = 0.6左右, 加IPTG (终浓度为0.4 mM) 诱导过夜, 收集菌液、裂解、制备蛋白样本, 进行15% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳确定其基因表达情况。2 结果与分析2.1 PCR扩增结果 以提取的铜绿假单胞菌标准株PAO1基因组DNA为模板, 用各自的特异性引物分别扩增这七种含Pilz结构域蛋白基因完整的开放阅读框。 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析, 结果显示特异性扩增出PA0012基因(267bp)、PA2799基因(300bp)、PA2960基因(357bp) 、PA2989基因(765bp) 、PA3353基因(792bp) 、PA4324基因(360bp) 和PA4608基因(380bp), 扩增产物片段大小与预期完全一致(图1，见封3)。2.2 表达载体的构建重组 分别将这七种含Pilz结构域蛋白基因的pET32a-Pilz重组质粒, 经BamH1和Hind 双酶切后, 可见大小约为6 kb 的pET32a载体片段以及大小不一的目的基因片段。片段大小与预期的完全一样 (图2，见封3), 且阅读框架正确, 证明该重组质粒已成功插入了目的片段。由于使用了高保真的Pfu DNA聚合酶, 序列测定结果表明, 重组质粒中所含的目的基因片段与NCBI中的Pilz结构域蛋白基因序列完全一致, 克隆过程中无碱基突变发生, 保证了编码氨基酸序列的正确表达。2.3 表达蛋白的SDS-PAGE检测 构建好的重组质粒, 经0.4 mmolL-1 IPTG诱导, 在大肠杆菌BL21中得到了大量表达 (图3，见封3)。pET32a 转化菌的诱导产物分别在大约10.1kD、11.2kD、13.4kD、29.4kD、30.9kD、14.0kD、15.1kD处有一条明显浓重的蛋白带(箭头所示)。 PA4324蛋白质分子量比预期分子量稍小, 这可能是由于其蛋白构型改变所致。其它表达的蛋白质分子质量大小与预期的蛋白质大小基本相符, 证明成功地构建了含Pilz结构域蛋白基因的原核表达载体, 这些表达载体在实验条件下全部得到了表达。3 讨论1986年, c-di-GMP只是作为纤维素合成酶异构激活因子而被发现3-4。直到最近几年, 作为一种广泛存在于细菌中的新型的第二信使, c-di-GMP对细菌生物学功能调控作用的重要性才被人们发现和认识, 并迅速形成了细菌学研究的前沿领域之一5-7。虽然c-di-GMP参与了细胞的多种生理活动, 但其作用机制尚不清楚。c-di-GMP 受体分子是什么?这些受体分子又是如何调控细胞如此众多的功能? 直到2006年Pilz结构域蛋白被实验证明是c-di-GMP的结合位点, 是c-di-GMP受体分子8, 它的发现对于阐明和认识c-di-GMP 信号传导通路具有里程碑意义。铜绿假单胞菌PA01菌株基因组大小为6.3Mb, 共有5670个基因, 这是已测及的最大的致病菌基因组之一。其基因组的大小和遗传复杂性与该菌具有极强的环境适应能力以及对多种抗生素耐受能力的观察相符合。铜绿假单胞菌全基因组测序工作的完成为深入了解其致病性及耐药的分子机制提供了平台。Pilz结构域在细菌中广泛分布, 为了寻找这种蛋白家族的其它成员, 通过Pfam数据库检索, 我们在铜绿假单胞菌PA01的全基因组序列上找到了八种Pilz结构域蛋白编码基因。 除Alg44蛋白(PA3542)为已知的c-di-GMP受体分子9, 其余七种蛋白(0012、PA2799、PA2960、PA2989、PA3353、PA4324和PA4608) 功能未知。PA2960是一种与细菌纤毛抽动性相关的蛋白, 近年有实验证明它在体内能与c-di-GMP分子结合7。能与c-di-GMP分子结合是这些蛋白成为其受体的必要条件,但 c-di-GMP受体的最终确定还需要进一步的功能研究。本实验对铜绿假单胞菌中七种编码Pilz结构域蛋白基因成功地进行了克隆并构建其原核表达载体, 为进一步研究它们是否第二信使c-di-GMP 潜在的受体分子奠定了实验基础。【参考文献】 1 CK Stover, XQ Pham, AL Erwin, et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen J. Nature, 2000,406:959-964.2 Kumar M, Chatterji D. Cyclic di-GMP: a second messenger required for long-term survival, but not for biofilm formation, in Mycobacterium smegmatisJ. Microbiology, 2008, 154:2942-2955.3 Ross P, Aloni Y, Weinbouse H, et al. Control of cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum: a unique quanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase J. Carbobydrate Res，1986, 149: 101-117.4 P Ross, H Weinhouse, Y Aloni, et al. Regulation of cellucose synthesis in Acetobacter xylinum by cyclic diguanylic acid J. Nature, 1987, 325: 279-281.5 RomLing U, Amikam D. Cyclic di-GMP as a second messenger J. Curr Opin Microbiol, 2006，9:218-228.6 Tamayo R, Pratt JT, Camilli A. Roles of cyclic diguanylate in the regulation of bacterial pathogenesis J. Annu Rev Microbiol, 2007, 61: 131-148.7 Amikam D, Galperin MY. 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