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赖氨酰氧化酶基因原核表达克隆的构建 作者：摆茹， 杨伟， 赵建宁， 韩梅【摘要】 目的 克隆编码人赖氨酰氧化酶(hLOX)的基因片段，并构建含有该基因的重组原核表达质粒，为制备基因工程化的重组hLOX奠定基础。方法 从人皮肤成纤维细胞中抽提RNA，通过RT-PCR扩增LOX编码序列(750bp)，所得目的基因插入原核表达载体质粒pET28a，转化大肠杆菌DH5。重组质粒pET28a-hLOX经双酶切和核苷酸序列分析鉴定。结果 载体质粒pET28a中插入的基因片段与hLOX基因序列完全相同。结论 成功构建含有人LOX基因的重组表达质粒。 【关键词】 赖氨酰氧化酶;RT-PCR;重组质粒赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidase，LOX)是一种细胞外依赖铜的胺氧化酶，参与细胞外基质中胶原和弹性蛋白赖氨酸残基交联，在胶原和弹性蛋白由可溶性单体转变为不溶性纤维过程的初始阶段发挥重要作用，对建立细胞外基质和维持基质结构和功能正常，以及组织器官发育、创伤修复、细胞运动等都具有重要意义1-2。本研究选取32KD的赖氨酰氧化酶基因为研究对象，拟从人皮肤成纤维细胞中克隆出目的基因，构建重组表达质粒，为今后表达重组hLOX、深入研究该蛋白的结构和功能打下基础。1 材料与方法1.1 细胞与试剂 人皮肤成纤维细胞、原核表达质粒pET-28a，E.coil DH5，均由军事医学科学院微生物与流行病研究所一室提供。DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料所，胰蛋白酶购自Difco公司。TRIZOL试剂购自Gibco公司，TaKaRa One Step RNA PCRKit (AMV)、EcoRI、Hind III内切酶、切胶回收试剂盒、小量质粒提取、DNA marker均购自TaKaRa公司。1.2 细胞培养 细胞培养于含10%胎牛血清/青霉素(100U/mL)/庆大霉素(100U/mL)的DMEM培养液中，置于饱和湿度，37、5%CO2的孵箱中生长。待细胞生长至对数期，进行总RNA的提取。1.3 总RNA的提取和cDNA的合成 按说明书步骤用Trizol抽提细胞总RNA。测定RNA样品在=260 nm和=280 nm的光密度值确定RNA的纯度，按1OD260=40g RNA计算RNA的浓度。按照cDNA第一链合成试剂盒说明合成cDNA第一链。1.4 PCR扩增目的基因hLOX 根据Gene Bank公布的hLOX序列(Gene Bank NM_002317)和载体质粒pET28a的多克隆位点和阅读框图谱设计引物，选择EcoR和Hind 作为将hLOX基因插入载体的内切酶。引物序列为：上游：5-CG GAATTC ATG GAC GAC CCT TAC AAC CCC T-3 含起始密码和EcoRI酶切位点;下游：5-GCGC AAGCTT CTA ATA CGG TGA AAT TGT GC-3含终止密码和Hind III酶切位点。以1st strand cDNA为模板扩增带有酶切位点的目的基因，目的片段约750 bp。同时用管家基因(GAPDH)作为对照检测总RNA的完整性和逆转录的效率。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯下迅速切割含750bp条带的凝胶条块，用小量胶回收试剂盒提取纯化PCR产物。1.5 重组表达质粒的构建及核苷酸序列分析 回收产物hLOX与质粒pET28a分别用EcoR和Hind 进行双酶切4 h，酶切产物分别割胶回收。将目的片段与载体质粒用T4DNA ligase连接过夜后转化E.coil DH5感受态细菌。挑克隆经菌落PCR，双酶切鉴定为阳性克隆，保种待用。经筛选的重组质粒作核苷酸序列分析。并用DNA star软件将测序结果与Gene Bank公布的hLOX序列(Gene Bank NM_002317)对比，同时鉴定插入片段两侧的酶切位点、起始及终止密码。测序正确的质粒命名为pET28a-hLOX。2 结果2.1 目的基因hLOX的RT-PCR电泳RT-PCR扩增后样品组特异性扩增产物大小750bp，管家基因对照组约500 bp，见图1。2.2 重组原核表达质粒双酶切鉴定重组表达载体pET28a/hLOX经内切酶EcoR、HindIII酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察，可见与理论值大小相符的两个条带，片段大小分别为750 bp和5369bp(图2)，分别为hLOX基因片段和pET28a载体片段。2.3 目的基因测序结果 经双酶切初步鉴定的重组质粒送样进行DNA测序(北京三博远志生物有限公司)。经过序列比对分析，结果表明，克隆序列与Gene Bank所公布序列(Gene Bank NM_002317) 100%吻合。测序结果如图3(见封2)。3 讨论LOX存在于人类、小鼠、大鼠、鸡、鱼等多种生物体中，广泛分布于多种组织器官，在心、肝、肺、子宫、卵巢、皮肤等均有表达，序列高度保守1-2。研究证明，LOX表达增高与动脉硬化、硬皮病、肝硬化等纤维化疾病的发生有关3-4;LOX表达降低与皮肤松弛、Menkes综合征、Ehler-Danlos综合征等疾病的发生有关5-6。LOX是由417个氨基酸残基组成的多肽1。人类LOX mRNA经过翻译形成分子量是48KD的前赖氨酰氧化酶原，其N-端有一个由21个氨基酸残基组成的信号肽序列，在细胞内酶的作用下，切去N-端的信号肽同时在高尔基体进行糖基化，形成分子量是50KD的赖氨酰氧化酶原，然后进入转运小泡，最后在细胞表面被Bone Morphogenetic Protein 1(BMP-1)剪切为分子量是32KD赖氨酰氧化酶7，分泌到细胞外，作用于细胞外基质和弹性纤维1，8。本研究选用人皮肤成纤维细胞作为RT-PCR的原始模板，是因为皮肤组织中LOX的表达量较高且稳定，尤以皮肤成纤维细胞为甚。所克隆的32KD赖氨酰氧化酶基因，其氨基酸序列是LOX全长中的第169位至417位的氨基酸序列，该段氨基酸序列具有酶活性。目前从组织细胞中分离LOX较难，而利用基因工程技术可实现蛋白的大量表达及分离，具有较好的应用前景。本研究所构建的重组质粒pET28a-hLOX，经过双酶切和测序鉴定证实原核表达载体构建成功，为今后表达重组hLOX、深入研究该蛋白与人类疾病的关系提供了实验室依据。【参考文献】 1 Csiszar K.Lysyl Oxidase：A Novel Multifunctional Amine Oxidase FamilyJ.Prog Nuclei Acid Res Mol Biol，2001，70：1-32.2 Kagan HM，Li W.Lylyl oxidase：properties，specificity，and biological roles inside and outside of the cellJ.Cell BioChem，2003，88：660-672.3 Chanoki M，Ishii M，Kobayashi H，et al.Increased Expression of Lysyl Oxidase in Skin with SclerodermaJ.British Journal of Dermatology，1995，133：710-715.4 Thomas R，Trompeter R，Duffy P，et al.Congenital Cutis Laxa and Lysyl Oxidase DeficiencyJ.Clin Genet，1997，51：109-114.5 Sibon I，Sommer P，Daniel Lamaziere J M，et al.Lysyl Oxidase Deficiency：a New Cause of Human Arterial DissectionJ.Heart，2005，91;33-35.6 Aimee S，Payne，Jonathan D Gitlin，et al.Functional Expression of the Menkes Disease Protein Reveals Common Biochemical Mechanisms Among the Copper-transporting P-type ATPasesJ.BioChem，1998，273：3765-3770.7 Mehmet Ilhan Uzel，Ian C.Scott，Hermik Babakhanlou-Chase，et al.Multiple Bone Morphogenetic Protein 1-related Mammalian Metalloproteinases Process Pro-lysyl Oxidase at the Correct Physiological Site and Control Lysyl Oxidase Activatio