帕金森病小鼠相关脑区内钙结合蛋白D28kmRNA的表达.doc

帕金森病小鼠相关脑区内钙结合蛋白D28k mRNA的表达 作者：王连刚武胜昔王喜青武毅军冯幼启 【关键词】 钙结合蛋白D28k 关键词: 钙结合蛋白D28k;帕金森病;PCR;原位杂交;小鼠 摘 要:目的 研究钙结合蛋白D28k（CaBP）在帕金森病（PD）发病机制中的作用. 方法 将1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）按30mg・kg-1 剂量腹腔注射给C57BL小鼠，建立PD鼠模型.用反转录PCR及原位分子杂交方法检测PD鼠和正常鼠脑内CaBP mRNA的表达变化. 结果 与正常鼠对比，CaBP mRNA在PD鼠的海马、纹状体、黑质等脑区的表达水平明显下调. 结论 CaBP可能通过对特定脑区神经元的保护作用来抵御PD的发生. Keywords:Calbindin-D28k;Parkinsons disease;PCR;in situ hybridization;mouse Abstract:AIM To study the possible role of Calbindin-D28k（CaBP）in the pathogenesis of Parkinsons disease（PD）.METHODS 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahy-dropyridine（MPTP）was intraperitoneally injected into C57BL mice to establish PD mice model.Reverse transcrip-tion PCR and in situ hybridization were used to detect the ex-pression changes of CaBP mRNA in the brain of PD and con-trol mice.RESULTS Compared to control mice，there was a significant decrease in CaBP mRNA levels in hippocampus，striatum and substantia nigra in PD mice.CONCLUSION CaBP may play a protective role for some neurons against the pathogenesis process responsible for PD. 0 引言 帕金森病（PD）的发病机制尚未清楚，有证据表明细胞毒性机制起着重要的作用.在一定的因素作用下，脑内一些区域的神经元受到毒性损害，使得其合成多巴胺的能力下降或丧失，导致PD症状的产生.1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）是一种神经毒素，可以诱导PD的产生，常用于PD动物模型的建立1 .CaBP是相对分子质量为28103 的钙结合蛋白，可以结合细胞内的钙离子，使细胞免受钙离子过高而产生的毒性作用，因此具有细胞保护作用2，3 .我们利用反转录PCR及原位杂交方法检测PD鼠脑内CaBP mRNA的表达变化，为探讨CaBP在PD发病机制中的作用提供依据. 1 材料和方法 1.1 动物模型的建立 C57BL小鼠18只，体质量2425g，实验前在安静环境中饲养至少24h以上.将小鼠随机分成两组.实验组（10只）小鼠每日腹腔内注射30mg・kg-1 MPTP，连续3d.对照组（8只）腹腔内注射等容量生理盐水. 1.2 反转录PCR 部分实验组（4只）和对照组（4只）小鼠于麻醉下经心灌流0.01mol・L-1 DEPC处理磷酸盐缓冲液后，快速取海马、纹状体及黑质，用Trizol试剂盒按常规方法提取总RNA，以oligo（dT）1218 及M-MLV反转录酶（Gibco）用反转录PCR法合成cDNA第一条链，置-30保存.CaBP引物由Takara公司合成，序列为:上游引物:5-TGG ATG ATA CGA AAC TTG GTG-3，下游引物为:5-GAA CAG CTT CAG CAT GAG GTC-3，扩增片段大小为394bp.以合成的cDNA为模板，进行PCR扩增.同时以-actin引物进行扩增，作对照.扩增产物经30g・L-1 琼脂糖凝胶电泳检测. 1.3 原位杂交 另一部分小鼠于麻醉下，快速断头取脑，置于干冰粉末中.恒冷箱切片，片厚14m，-70冰箱中保存备用.实验所用CaBP探针为含39个碱基的寡核苷酸探针，其序列与小鼠脑内CaBP的一部分（454492号碱基）相互补2 ，探针用3末端标记法及-35 SdATP（Amersham）标记.其特异放射活性为3050GBq・g-1 .切片快速干燥后依次入40g・L-1 多聚甲醛，0.1mol・L-1 PB及杂交前处理液.杂交时将200300L杂交液（含500mL・L-1 甲酰胺，0.25g・L-1 tRNA，100g・L-1 硫酸葡聚糖，10Denharts液），15L DTT及标记探针滴于切片表面，置湿盒中于40孵育48h.杂交后，用1SSC冲洗（55，320min），最后将LM-1型乳胶（Amersham）涂于切片表面，暗盒中曝光（4）.4wk后，用Kodak D-19显影液显影，F-5坚膜定影液定影，10g・L-1 硫堇复染.脱水、透明、封片，光镜下明、暗观察. 统计学处理:利用Labworks软件对PD小鼠及对照组小鼠各脑区CaBP及-actin的PCR产物的电泳条带密度进行测定，用各CaBP条带的密度值/对应的-actin的条带密度值的相对密度值来表示CaBP mRNA在各脑区的表达水平.利用Leica-500图像分析仪对各组小鼠各脑区内CaBP mRNA杂交信号的强度进行检测.对所得结果用t检验进行统计学分析. 2 结果 2.1 反转录PCR结果 用反转录PCR对CaBP mRNA表达水平的检测结果见Fig1.与对照组相比，PD小鼠脑内海马、纹状体及黑质内的CaBP mR-NA的表达水平明显下调.PD鼠与对照小鼠上述脑区内CaBP扩增产物的条带密度有明显差异（Fig2）.以-actin引物进行扩增的产物的量，在PD小鼠与对照小鼠间基本相等，表明在试验过程中所加模板的量是一致的（Fig1）. 图1 图2 略 2.2 原位杂交结果 PD小鼠海马、纹状体及黑质内CaBP mRNA的杂交信号强度明显低于对照组（Tab1），而且CaBP mRNA阳性神经元的数量也有下降. 表1 PD鼠及对照小鼠脑内CaBP mRNA杂交信号强度略 3 讨论 我们观察到在PD小鼠脑内的海马、纹状体、黑质等区域的CaBP mRNA表达水平明显降低，表明在PD条件下，这些区域的神经元合成CaBP的能力下降.海马、纹状体及黑质是PD时主要的病变区域，因此CaBP的下调可能与PD的发病有密切关系. 既往的一些研究结果表明CaBP的变化与衰老及神经变性疾病有关4 .衰老往往伴随着富含CaBP的区域如小脑、基底核等的神经元的丢失5 .CaBP的减少还参与Alzheimer的发病5 .发育方面的研究还证实CaBP的合成与神经元细胞骨架的形成有关.细胞骨架对维持神经元的正常生理功能具有非常重要的作用，而细胞骨架的形成具有钙离子依赖性，过量的细胞内钙则可破坏细胞骨架的形成6 .超微结构的研究表明CaBP位于细胞质基质及细胞骨架上，可以结合细胞内过剩的钙离子，从而使神经元免受细胞内钙水平的影响，对神经元的活性及正常功能具有保护作用. 在给予MPTP诱发的PD状态下，海马、纹状体、黑质等与PD发病密切相关的脑区的神经元对CaBP的合成能力下降或丧失，从而对细胞内钙离子水平的调节能力下降，神经元对由于细胞内钙离子浓度升高所造成的细胞毒性作用不能予以抵御，导致神经元活性下降甚至死亡，这可能是PD的发病机制之一.因此CaBP具有神经保护作用，神经元内CaBP正常浓度的保持对维持神经元的活性，防止PD的发生具有非常重要的作用. 参考文献: 1Schneider JS，Yuwiler A，Markham CH.Selective loss of sub-population of ventral mesencephalic dopaminergic neurons in the monkey following exposure to MPTP J.Brain Res，1987;411（1）:144-149. 2Hunziker W，Schrickel S.Mouse brain calbindin D28K:Six do-main structure and extensive amino acid homology with chicken calbindin D28J.Mol Endocrinol，1985;2（3）:465-468. 3Iacopino AM，Quintero ME，Miller EK.Calbindin-D28k:A po-tential neuroprotective protein J.Neurodegeneration，1994;3（1）:1-6. 4Heizmann CW，Braun K.Changes in Ca2+ -binding proteins in human neurodegenerative disorders J.Trends Neurosci，1992;15（2）:259-263. 5Iacopino AM，Christakos S.Specific reduction of calcium-bind-ing protein（28-kilodalton calbindin-D）gene expr