大鼠蛛网膜下腔出血后海马中Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ的ｍＲＮＡ表达.doc

大鼠蛛网膜下腔出血后海马中和的表达作者：林琳李冬松陶春汤文丽吕品刘月英宋宝华宝鲁尔【摘要】 目的 通过对大鼠实验性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的观察，对缺血缺氧造成的脑损伤机制进行探讨。方法 用反转录聚合酶链式反应技术检测大鼠SAH后CVS时海马组织Bcl-2和Bax mRNA的表达变化。结果 Bcl-2 mRNA的表达水平在蛛网膜下腔组1 d时即开始下降，57 d时降至最低。Bax mRNA的表达1 d呈上升趋势，57 d时达最高。在对照组和假手术组海马组织内的Bcl-2和Bax mRNA的表达水平保持相对恒定。结论 提示Bcl-2 和Bax可能参与了缺血缺氧所致的神经元损伤。 【关键词】蛛网膜下腔出血；海马；大鼠；Bcl-2；Bax 【Abstract】 Objective Through the rat cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage observation，the hypoxic ischemic brain injury caused by the mechanism discussed.Methods Use reverse transcription-polymerase chain reaction test after SAH CVS rat hippocampus when the Bcl-2 and Bax mRNA expression of.Results Bcl-2 mRNA expression in subarachnoid hemorrhage a day that started to decline,57 days to a minimum.Bax mRNA expression of an upward trend，57 days to a maximum.In the control group and the sham group within the hippocampus of the Bcl-2 and Bax mRNA expression levels remained relatively constant.Conclusion Bcl-2 and Bax may be involved in the hypoxic ischemic damage caused by the neurons damage. 【Key words】Subarachnoidhemorrhage； Hippocampus；Rats；Bcl-2；Bax 蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH），后40%80%发生迟发性脑血管痉挛(cerebral vasospasm，CVS)1，导致脑缺血和缺氧，严重时发生梗死，成为致死致残的主要原因2。本实验采用大鼠枕大池二次注血法建立CVS 动物模型，利用反转录聚合酶链式反应技术动态观察SAH后海马组织内Bcl-2和Bax mRNA的表达变化，并对两者与神经元凋亡的关系及其与SAH后CVS导致缺血性脑损伤的机制进行探讨，为临床上有效防治CVS引起的脑损伤提供思路和依据。 1 材料与方法 11 动物与分组 健康SD大鼠72只，体质量380410 g，雌雄不限，由吉林大学实验动物中心提供，动物随机分成9组，正常对照组8只、假手术组32只和SAH组32只，各组根据术后处死时间不同再分为假手术1、3、5、7 d组和SAH 1、3、5、7 d组，每组各8只大鼠。如下分组：1组：正常对照组；2组：假手术对照1 d组；3组：SAH 1 d组；4组：假手术对照3 d组；5组：SAH 3 d组；6组：假手术对照5 d组；7组：SAH 5 d组；8组：假手术对照7 d组； 9组：SAH 7 d组。 12 试剂 由北京鼎国生物技术有限责任公司提供。 从基因文库中查到大鼠Bcl-x和Bax基因cDNA序列，应用Oligo 50软件程序设计上、下游引物：引物设计：Bcl-2引物：上游5-CCGGGAGATCGTGATGAAGT-3；下游5-ATCCCAGCCTCCGTTATCCT-3。Bax引物为：上游5-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3；下游5-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3。利用上述引物推导的PCR 产物的大小分别为：Bcl-2，376 bp；Bax，284 bp。 13 方法 131 模型建立 10%水合氯醛(035 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，大鼠俯卧位固定于操作台上，项部备皮消毒。纵行切开颈部皮肤，暴露枕骨、环椎及环枕膜，用注射器针头刺破环枕膜到达枕大池，有脑脊液流出后，由左眼球后静脉丛抽取03 ml无抗凝自体血，以01 ml/min注射速度缓慢将015 ml/100 g的自体不抗凝血注入枕大池。明胶海绵压迫。将大鼠头低30俯卧位30 min，以利血液凝固沉积在脑底血管周围。大鼠保温复苏至清醒后自由饮食饮水。48 h后同法操作制成大鼠SAH动物模型。假手术组动物按上述方法在枕大池内注入同样量的生理盐水2次，对照组只做手术不注射。在第2次注射后第1，3、5、7天取脑待检。 132 标本取材 各时点大鼠均以10%的水合氯醛(035 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，经心脏灌流快速灌入生理盐水300400 ml冲洗，右心房流出颜色鲜亮的液体，4%中性多聚甲醛400 ml灌流，打开颅腔，快速取出海马，-80保存。 133 组织中总RNA提取 采用TRIzol法提取总RNA。取50100 mg组织/ml Trigol，加入预冷的Trigol提取液，加入少量液氮充分匀浆，其余步骤严格按提取液说明书进行。所得溶解于无NRnase水中，-80保存。 134 逆转录反应 合成第一链cDNA具体反应体系为：在40 l的反应体积中总RNA 5 g；加入5缓冲液Bufter 8 l；dNTPmixyure 10 ml/U，2 l；digo（dT）18，2 l；AMU 05 l；DEPC水补充到50 l。置室温10 min，42水育1 h，冰水冷却2 min，合成cDNA，-20保存。 135 PCR扩增 合成的cDNA进行PCR扩增，步骤：在25 l反应体积中加入cDNA 01 g；10PCR 缓冲液（Bufter）25 l；dNTPmixyure 10 ml/U，2 l，DNA聚合酶（Takara）25 l；MgCl2 25 l；各引物05 l；循环条件：93、30 s，55、72 1 min，30 s，33个循环。 136 Bcl-2、Bax的表达 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统进行照相扫描并进行密度分析。 137 统计学方法 用Labworks 软件对各阳性条带的密度进行测量，测得的Bcl-2和Bax 阳性条带的密度作为其mRNA的表达量。采用SPSS软件作方差分析，以P<005为差异有统计学意义。 2 结果 21 RT-PCR检测结果 用RT-PCR方法在实验大鼠的海马组织中检测到了Bcl-2和Bax mRNA的表达且表达呈规律性变化，关系非常密切。在正常对照组大鼠海马组织中检测到了Bcl-2和Bax mRNA的表达，凝胶电泳结果显示Bcl-2，Bax的PCR扩张片段的位置大小分别为Bcl-2，376 bp；Bax，284 bp（图1）。与利用各对特异性引物所推导的PCR扩增产物的大小相一致。 211 海马组织内 Bax mRNA 的表达水平 正常对照组与假SAH 组Bax mRNA 的表达水平均较低，假SAH 组Bax mRNA 的表达水平与正常组比较无明显变化（P>005）；SAH组：在SAH 后1 d Bax mRNA的表达不明显，3 d Bax mRNA的表达开始明显升高（P<005），57 d时达最高，以上均显著高于正常组及同一时间点的假手术组（P<001）。见图1，表1。 212 海马组织内Bcl-2 mRNA的表达 正常对照组与假手术组各时间点的Bcl-2 mRNA的表达差异无统计学意义（P>005）；SAH组Bcl-2 mRNA的表达水平：1 d开始有呈下降趋势，3 d时即有明显降低，5 d时降至更低，7 d时最低，与正常对照组及同时间点的假手术组相比差异有统计学意义（P<001）。见图1，表1。 3 讨论 现代医学的发展已证实细胞凋亡是许多疾病的发病机制。近年来研究显示，凋亡也是缺血性脑损伤组织迟发性神经元死亡的显著特点。蛛网膜下腔出血（SAH）后诱发的脑血管痉挛（CVS），导致脑组织不同程度的缺血缺氧损害，发生了多种物质共同参与的脑神经组织细胞凋亡，原癌基因B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族是细胞凋亡相关因素中最受关注的基因之一。Bcl-2蛋白家族成员在细胞凋亡中起两种截然相反的作用，一类为促生存家族促生存家族包括Bcl-2、Bak、Bcl-xL等，Bcl-2基因主要定位于线粒体膜、核膜、内质网上。另一类为促凋亡家族，包括Bax等。在细胞凋亡的调控过程中，Bcl-2基因家族的表达蛋白具有重要意义3。研究表明，Bax的过度表达及Bcl-2表达的相对不足是导致SAH后细胞凋亡即造成神经损伤的重要环节4，细胞凋亡减弱时Bcl-2表达增强，反之凋亡增强时Bcl-2表达减弱而Bax增强5。有人认为6，Bcl-2抑制细胞凋亡作用是与其形成异源二聚体有关，Bcl-2高表达时，其形成异源二聚体Bcl-2/Bax而抑制调亡，Bax亦是通过与线粒体上Bcl-2蛋白形成二聚体发挥作用，Bax高表达时其形成同源二聚体Bax/Bax而诱导凋亡。Bax与Bcl-2的相对比值在决定细胞生存或死亡中也可能起关键性的作用，但它在细胞凋亡过程中发挥怎样的作用还不太清楚7。由于海马区神经元对缺血具有选择性敏感，所以海马成为缺血性脑损伤研究的一个典型脑区8。笔者用枕大池二次注血法建立的SAH大鼠脑血管痉挛模型上，笔者观察到SAH组动物海马内Bcl-2和Bax mRNA的表达变化，在SAH发生后的1 d，Bcl-2 mRNA的表达开始出现降低趋势，3 d明显降低，57 d降低到最低水平；而Bax mRNA在SAH组表达随SAH时间的延长呈现增高，1 d组只有轻微表达，3 d组开始明显表达，57 d时最高，表明在SAH组脑缺血后海马神经元中凋亡抑制因子Bcl-2的表达受到抑制和凋亡促进因子Bax的表达增强，Bcl-2和bax的比值发生了转变，这一表达和比值的改变可能促进了海马神经元的凋亡9，这可能是SAH 后CVS 造成缺血性脑损伤的机制之一。 从本实验结果还可以看出，海马内Bcl-2和BaxmRNA的表达变化最早出现在SAH发生后的1 d，提示SAH 后CVS 导致的海马神经元的损伤在早期即可发生，37 d损伤严重，这一结果和临床报导一致10-11，有人发现丙戊酸钠可诱导Bcl-2的表达，抑制Bax的表达，使Bcl-2与Bax的比值增大，发挥抗细胞凋亡作用12。然而，SAH后CVS的神经损伤机制和环节非常复杂，相关措施应用于临床发挥治疗作用尚需进一步研究和证实。但可以预见，从分子和基因水平干预SAH后CVS的损伤过程，减少神经元凋亡，将会给临床治疗带来希望。 参 考 文 献 1 徐庶，高阳，王枫，等.尼莫地平联合依达拉奉对蛛网膜下腔出血大鼠海马神经细胞的保护作用.中国脑血管病杂志，2008，5（4）：172-176. 2 庞刚.蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的发生机制研究进展.广西医学，2007，29（6）：853-855. 3 吴有志，徐善水.细胞凋亡及其基因调控与脑血管痉挛.神经疾病与精神卫生，2006，1（1）：61-63. 4 石义亭，赵毅，张新东.脑出血灶周组织Bax、Bcl-2的表达与神经元凋亡关系的实验研究.中国实用神经疾病杂志，2006，9（2）：2. 5 Hara A，Iwai T，Niwa T，et al.Immuno histochemical detection of Bax and Bcl-2 proteins in gerbil hippocampas following transient forebrain ischemia.Brain Res,1996,711(1-2):249-253. 6 Denecker G,Vercammea D,Dedercg W,et al.Apoplic and necrolic cell death induced by death receptprs.Cell Mol Life Sci,2001,58(3):356-370. 7 吴晓黎，何志义.脑缺血后的神经发生与凋亡.国外医学脑血管疾病分册，2004，12（10）：778-781. 8 White BC，Groosman LT，ONeil BJ，et al.Global brain ischemia and reperfusion.Ann Etnerg Med,1996,27(5):588-594. 9 侯明山，李茂林，马兰香.犬颅脑枪弹伤后心肌细胞凋亡及bcl一的表达.第四军医大学学报，2007，28(17)：