基因串联体下丽蝇抗病毒肽Alloferon1的构建和表达.doc

基因串联体下丽蝇抗病毒肽Alloferon1的构建和表达【关键字】医学， 抗病毒肽 抗病毒肽 抗病毒肽 抗病毒肽【摘要】 目的： 克隆和表达Alloferon1基因2串联体. 方法： 利用同尾酶法基因同向串联方案，在人工合成Alloferon1全基因的基础上，将Alloferon1基因由单体连接成2串联体，继而将获得的正确Alloferon1基因2串联体插入pGEX4T1表达载体诱导表达. 结果： 构建的Alloferon1基因2串联体经酶切和DNA测序分析，结果表明该基因串联体的序列与设计的序列完全相同. Alloferon1基因2串联体插入pGEX4T1载体后，重组菌经37诱导4 h，SDSPAGE分析结果显示，该串联体得到较高水平的表达. 结论： Alloferon1基因2串联体的构建与表达均获得了成功. 【关键词】 抗病毒肽；基因,Alloferon1；同尾酶；同向串联；大肠杆菌【Abstract】 AIM： To clone and express a tandem of repeated gene recombinant plasmid pGEX4T1(Alloferon1)2.METHODS： Whole Alloferon1 gene was synthesized and inserted into pUC18 cloning vector. Double repeats of Alloferon1 gene were obtained with isoschizomer construction method. Then the correct tandem of gene repeats was inserted into EcoRI and SalI sites of pGEX4T1 expression vector. RESULTS： The sequencing and restriction enzyme digestion analysis showed that 2repeat tandem of Alloferon1 gene was connected correctly and cloned into pUC18 vector. After the recombinant bacteria was induced at 37 for 4 h, a new anticipated protein band with relative molecule mass of 32103 was found on SDSPAGE gel. CONCLUSION： The correct tandem of 2 repeats of Alloferon1 gene is constructed and expressed in E.coli successfully.【Keywords】 antiviral peptide； genes, Alloferon1； isoschizomer； tandem； Escherichia coli0 引言 Alloferon1是俄国科学家Chernysh等1于2002年从人工干预热灭活大肠杆菌和金黄色葡萄球菌丽蝇幼虫血淋巴中分离得到的一种抗病毒和抗肿瘤的小肽，是由13个氨基酸残基组成的阳离子肽，其一级结构与昆虫防御素，天蚕素，富含脯氨酸的抗菌肽相似.研究表明Alloferon1对甲型乙型流感病毒、肝炎病毒和慢性髓性白血病K562细胞均有抑制作用，是一个具有潜在应用价值的小活性肽. 由于其分子质量较小，克隆、表达、纯化、检测都会有一定难度，本实验拟采用同尾酶法基因同向串联的方法2，将Alloferon1基因串联起来，构建该基因的2串联体后表达该串联体，以增加其稳定性和表达量，为进一步的纯化和生物活性测定奠定基础.1 材料和方法1.1 材料 大肠杆菌DH5，质粒pGEX4T1均为本室保存；质粒pUC18，T4 PNK，限制酶，Xgal，DNA maker，IPTG均购自TaKaRa公司，UNIQ10柱式DNA胶回收试剂盒，小量质粒提取试剂盒均购自天根公司，其它试剂均为国产分析纯，基因由上海生工合成.1.2 方法1.2.1 Alloferon1基因的设计与合成 根据瑞士微生物肽数据库（APD）收录的Alloferon1氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱密码子设计合成该基因序列，利用XbaI和NheI互为同尾酶的特点，在基因的两端加入了EcoRI，SalI限制性内切酶切割后的粘性末端和XbaI，NheI限制性内切酶位点，以便于构建串联体和表达在XbaI位点后和NheI位点前加入蛋氨酸密码子，以便于表达串联体之后将其裂解为单体.1.2.2 Alloferon1基因的复性、磷酸化和纯化 将合成的Alloferon1全基因片段溶解于适量灭菌双蒸水中，95水浴5 min后，关闭水浴锅自然冷却至30以下. 退火的Alloferon1基因片段用T4 PNK进行磷酸化，37水浴30 min，70水浴灭活10 min. 磷酸化后的Alloferon1基因片段用乙醇沉淀的标准方法回收.1.2.3 Alloferon1基因2串联体的构建 将Alloferon1基因与用EcoRI和SalI限制性消化的pUC18 DNA连接后转化大肠杆菌DH5，通过蓝白斑筛选出克隆重组子. 将上述克隆重组子以NheI酶切初步鉴定后进行DNA测序，将获得正确序列的克隆重组质粒命名为pUC18Alloferon1. 取上述重组质粒两份，一份用ScaI和XbaI双酶切后回收大片段，另一份用ScaI和NheI双酶切后回收小片段，将上述回收的大小片段连接后转化大肠杆菌DH5. 通过蓝白斑筛选出2串联体克隆重组子. 将上述重组子用EcoRI和SalI酶切初步鉴定后进行DNA测序，将获得正确序列的2串联体克隆重组质粒命名为pUC18(Alloferon1)2. 以上过程均参照文献3 进行.1.2.4 Alloferon1基因 2串联体的表达 将获得的2串联体重组质粒pUC18(Alloferon1)2用EcoRI和SalI酶切后回收小片段（2串联体），与经相同内切酶消化处理的pGEX4T1DNA连接转化BL21菌株，提取重组质粒DNA, 以EcoRI和SalI双酶切初步鉴定后进行DNA测序鉴定，得到有插入片段的正确克隆命名为PGEX4T1(Alloferon1)2. 将阳性菌株铺于含Amp的LB固体培养基上过夜生长，随机挑取单菌落接种于2 mL含Amp的LB液体培养基中37活化过夜，次日按5%的比例接种于LB液体培养基中，37培养至对数生长期后加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG继续培养25 h，离心收集菌体，做SDSPAGE.2 结果2.1 Alloferon1基因2串联体的构建鉴定 （1）按照设计的方案进行操作，获得了Alloferon1基因2串联体（图1）. 从图中可见，经EcoRI和SalI双酶切pGEX4T1(Alloferon1)2重组质粒之后，在约110 bp处可见一条清晰的DNA条带，其大小与理论计算值相符. （2）重组的pGEX4T1(Alloferon1)2质粒DNA经双脱氧末端终止法测序（图2）此分析结果证明，本研究构建的Alloferon1基因2串联体DNA序列与设计的序列完全相同.2.2 Alloferon1基因2串联体的表达 含重组pGEX4T1(Alloferon1)2的菌株经IPTG诱导表达后，经SDSPAGE分析，在37诱导后，含pGEX4T1(Alloferon1)2细菌裂解上清中出现了一条Mr约为32103的新生GST融合蛋白带，其分子质量大小与理论计算值相符（图3）.M： Maker； 1： pGEX4T1(Alloferon1)2； 27： pGEX4T1(Alloferon1)2/ EcoRISalI.图1 重组pGEX4T1(Alloferon1)2质粒的酶切分析（略）5AATTCTCTAGAATGCATGGTGTTAGCGGTCATGGTCAGCATGGTGTTCATGGTATG GCTAGAATGCATGGTGTTAGCGGTCATGGTCAGCATGGTGTTCATGGTATG 3 GCTAGA：Sequence of ligation site of XbaI and NheI.图2 Alloferon1基因2串联体的DNA序列（略）M： Protein Marke； 1： pGEX4T1诱导； 2： pGEX4T1(Alloferon1)2诱导前； 3： pGEX4T1(Alloferon1)2诱导3 h； 4： pGEX4T1(Alloferon1)2诱导4 h.图3 Alloferon1基因2串联体的表达分析（略）3 讨论 抗病毒肽类药物以其活性高、疗效稳定、毒副作用小等突出特点, 已成为抗病毒药物研发的一支奇兵，由于抗病毒肽在生物体内含量很少，从天然中大量分离提取显然有一定困难，而超过10个氨基酸残基多肽的化学合成成本很高4-5，所以基因工程表达成为大量生产的首选解决方案. 但由于分子量较小，其克隆、表达、纯化和检测都会有一定困难，且表达产物对宿主有毒性，不宜在原核系统中直接表达，所以常常采用融合蛋白的策略进行表达，即使这样也往往因为目的蛋白在融合蛋白中所占比例较小，产量也难有较大的提高. 本研究拟采用构建多拷贝串联体的方法，以期获得较高表达量的蛋白. 目前，基因串联体的构建方法包括随机定向串联法、PCR扩增串联法、化学拼接法和同尾酶法等6. 本实验选择了同尾酶法，在目的基因的5和3端分别设计了XbaI和NheI这对同尾酶的酶切位点，构建成功的重组质粒pUC18Alloferon1上只有一个XbaI和NheI的酶切位点，之后我们选择了重组质粒pUC18Alloferon1上仅有的一个且位于多克隆酶切位点外的ScaI作为构建串联体的另一个酶切位点，当用ScaI和XbaI双酶切重组质粒pUC18Alloferon1后，回收的大片段含有一个Alloferon1基因；当用ScaI和NheI双酶切重组质粒pUC18Alloferon1后，回收的小片段也含有一个Alloferon1基因，将此两片段连接在一起后就形成了Alloferon1基因的二串联体重组质粒pUC18(Alloferon1)2，由于XbaI和NheI两者的粘性末端连接起来后形成了一个新的酶切位点，该酶切位点就再不能被XbaI和NheI切开. 所以从理论上讲，只要不超出一定的范围，就可以随意选择构建基因串联体的大小. 另外我们在XbaI位点后和NheI位点前还加入了蛋氨酸密码子，构成溴化氰裂解位点，以便于表达串联体后将其裂解为单体. 本实验成功构建了丽蝇抗病毒肽Alloferon1基因二串联体，该串联体在大肠杆菌中获得了较高水平的表达，为该肽和基因工程抗病毒药物的研发奠定了基础.【参考文献】 1 Chemysh S, Kim SI, Bekker G, et al. Antiviral and antitumor peptides from insects J. Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99(20):12628-12632.2 韩 苇, 颜 真, 王俊楼, 等. EPO模拟肽基因4串联体的构建和表达J. 第四军医大学学报,2001,22(4):319-312.3 萨姆布鲁克J, 拉塞尔 DW. 分子克隆实验指南M. 3版,北京: 科学出版社,2003:76-99.4 Jac H, Lee L, Min C, et al. Acidic peptidemediated expression of the antimicrobial peptide as tandem repeats in Escherichia coli J. Protein Purif,1998,12(1):53-60.5 Sidorova MV, Molokoedov AS. T