哮喘豚鼠模型肺和骨髓中CCR3及CD34的表达及意义.doc

哮喘豚鼠模型肺和骨髓中CCR3及CD34的表达及意义 作者：陈德忠, 付国昊, 朱述阳, 吕丽丽 赵传云【摘要】 目的: 观察哮喘豚鼠肺和骨髓组织CCR3及EOS不同时相表达的变化, 探讨哮喘发病的可能机制。方法: 用卵白蛋白(OVA)和生理盐水致敏法制备豚鼠哮喘和对照模型, 分为正常对照组（N）及哮喘组（A、 B、 C、 D、 E）, 每组8只, 于激发后30 min, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h处死, 瑞氏染色计数骨髓涂片和外周血涂片中EOS比例, 免疫组织化学技术检测骨髓中CCR3及CD34蛋白的表达; 制备豚鼠肺组织病理标本, 苏木精伊红染色, 免疫组化检测肺组织中CCR3和CD34的表达。结果: (1)哮喘组骨髓和外周CCR3与CD34及EOS表达明显增加; (2)OVA激发后, 骨髓和外周CCR3、 CD34及EOS表达: 30 min变化不明显（肺内CD34表达增加）, 6 h（肺内CD34表达下降）、 12 h达到峰值, 24 h开始下降, 48 h恢复正常水平; (3)骨髓的变化早于外周, CCR3的表达高峰早于CD34表达与EOS的增多高峰, 且CCR3、 CD34和EOS互呈线性相关（肺组织内除外）。结论: 哮喘豚鼠肺组织和骨髓之间存在骨髓CD34祖细胞、 EOS细胞到循环再到肺组织的通路, 骨髓和肺组织CCR3表达增强, 为CD34细胞、 EOS从骨髓快速募集到肺组织提供了可能。 【关键词】 支气管哮喘; CCR3; CD34; 骨髓; 豚鼠 哮喘是多种细胞（如嗜酸粒细胞、 肥大细胞、 淋巴细胞、 中性粒细胞和气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道炎症性疾患, 哮喘气道炎症的特征性改变为嗜酸粒细胞（EOS）的浸润和活化。气道黏膜下的 EOS主要来源于骨髓CD34+干细胞在某些细胞因子(如eotaxin, IL5)的诱导下分化成熟为EOS, 释放入外周血, 在多种趋化信号的引导下向肺内定向募集。这一现象意味着从骨髓循环气道, 存在着调控EOS及其祖细胞定向迁移的信号通路。趋化因子eotaxin对EOS有高度的特异性, 其受体3(CCR3)在EOS膜上大量存在, 且与eotaxin 有高度亲和性, eotaxin是强有力的EOS趋化剂, eotaxin和CCR3 在哮喘发病机制中起重要作用。本实验我们探讨哮喘发作时骨髓和气道之间的调控EOS定向迁移信号通路; 通过研究CCR3及CD34的表达, 分析CCR3及CD34的改变对EOS在骨髓增殖分化及其在肺组织趋化和浸润的调节作用, 为临床开发治疗哮喘新方法提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料 雄性豚鼠48只, 体质量(25050)g, 由徐州医学院动物中心提供。随机分为对照组（N）、 哮喘组(根据处死时间分为A、 B、 C、 D、 E组), 每组8只。鸡卵白蛋白(ovalbumin, OVA, 美国Sigma公司)、 CCR3、 CD34多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒(武汉Boster公司)、 奥林巴斯图像采集系统、 德国百瑞雾化器和自制雾化箱。 1.2 方法 1.2.1 哮喘模型的建立 哮喘组于第1天腹腔注射抗原混悬液1 mL (OVA 100 mg、 氢氧化铝200 mg), 2周后将豚鼠放于自制雾化吸入箱内, 喷射雾化吸入10 g/L OVA 20 min, 连续5 d1。对照组于第1天腹腔注射1 mL生理盐水, 2周后喷射雾化吸入生理盐水20 min, 连续5 d。最后1次雾化吸入后, 哮喘组A、 B、 C、 D、 E分别于30 min, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h处死动物, 对照组12 h处死, 取材并作相应测定。 1.2.2 骨髓和外周血EOS计数 于末次激发后, 断颈处死豚鼠, 取颈动脉血制作血涂片。取两侧股骨, 去掉两端骨骺, 剖开骨干髓腔, 以含肝素1667 kat/L的生理盐水溶液将骨髓细胞冲洗出, 4, 1 000 r/min离心5 min后沉渣, 涂于多聚赖氨酸处理的玻片上, 干燥后以40 g/L多聚甲醛固定30 min, -20保存备用。骨髓和外周血涂片用瑞氏染色, 随机计数200个白细胞, 并计算其中EOS百分比。 1.2.3 骨髓细胞CCR3、 CD34表达的检测 采用SABC免疫组织化学法检测骨髓中CCR3、 CD34的表达。以兔抗大鼠CCR3 IgG为一抗, 以生物素化的羊抗兔IgG为二抗。取骨髓沉渣涂片, 按SABC免疫组化试剂盒说明书处理。在光镜下观察结果, 胞膜为棕黄色者为阳性细胞, 在光镜(400)下随机选取5个视野, 计数阳性细胞数占白细胞总数的比例。 1.2.4 肺组织EOS计数及CCR3、 CD34表达的检测 无菌操作下切取部分肺组织, 40 g/L多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋、 切片, 分别进行HE染色、 CCR3、 CD34免疫组化染色(严格按武汉Boster公司SABC试剂盒说明书操作) 。肺组织切片HE染色后, 每张切片计数200个细胞, 计算其中EOS百分比。免疫组化计数方法: 光镜下观察胞膜着棕黄色为阳性细胞。每例选择1张染色较好的切片, 显微镜下随机选取5个高倍视野(400), 计数, 取每视野的均数。 1.2.5 统计学分析 计量数据均采用xs表示, 用 Stata7.0软件对数据进行t检验和相关分析, P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 哮喘豚鼠气道病理学改变 肺组织HE染色光镜下可见: 与对照组相比哮喘组大、 中、 小支气管收缩, 黏膜水肿, 平滑肌增厚, 上皮细胞肿胀, 部分上皮细胞变性、 坏死脱落, 杯状细胞增生, 支气管管腔狭窄甚至闭塞, 黏液栓形成; 支气管周围血管扩张、 充血, 黏膜、 黏膜下层及肺泡区有大量的炎症细胞浸润, 主要为EOS、 淋巴细胞、 单核细胞; 肺泡间隔增厚。激发后30 min上述改变不明显, 6 h, 12 h肺组织病变最明显, 24 h, 48 h逐渐恢复到正常肺组织表现(图1)。 2.2 外周血涂片、 骨髓细胞涂片及肺组织EOS计数 哮喘（豚鼠）激发后30 min, 与对照组相比变化不大, 且外周血EOS百分比稍有下降, 但无统计学意义; 6、 12 h升高明显(P<0.01); 24 h开始下降(P<0.05); 48 h基本恢复到正常水平。哮喘组不同时间点之间EOS也存在着变化: 6 h较30 min, EOS升高明显(P<0.01); 12 h较6 h, 肺组织EOS变化不大(P>0.05), 骨髓和外周血升高(P<0.05); 24 h较12 h, 48 h较24 h, EOS呈下降趋势(P<0.01); 6、 12 h时EOS增多最明显, 与气道病理学改变相一致, 24 h开始下降, 48 h回到正常水平。 骨髓变化先于肺和外周血, 且持续时间短(图2)。 2.3 肺组织和骨髓中CCR3和CD34蛋白的表达 哮喘组肺组织和骨髓中CCR3和CD34蛋白阳性细胞呈棕黄色, 主要定位于细胞膜。肺组织中, 气道黏膜、 黏膜下层及血管周围、 肺泡区有大量呈棕黄色的阳性细胞, 气道黏膜上皮细胞、 血管内皮细胞及平滑肌细胞也有CCR3及CD34蛋白表达, 对照组在上述部位仅少量表达。骨髓细胞中, 呈棕黄色CCR3 蛋白阳性细胞大量表达于各阶段Eos细胞表面; 而CD34大量表达于未成熟的EOS祖细胞表面.不同时间点CD34的表达趋势和EOS的变化一致: 与正常组相比, 激发后30 min, 肺组织内表达升高（P<0.05）, 骨髓内略有下降, 不明显（P>0.05）; 6 h时, 肺内表达下降, 骨髓内开始升高（P<0.01）; 12 h时, 肺组织和骨髓内CD34表达达到高峰（P<0.01）; 24、 48 h逐渐下降, 恢复到正常水平。但是CCR3的表达则稍有不同: 与对照组相比骨髓及肺组织中CCR3 30min时开始升高（P<0.05）; 6、 12 h达到高峰（P<0.01）; 24 h开始下降（P<0.05）; 48 h基本恢复到正常水平; 骨髓先升高, 肺组织随着变化, 但持续时间长于骨髓。表1 肺组织和骨髓中CCR3/CD34蛋白的表达 2.4 肺组织和骨髓EOS表达与CCR3蛋白表达的关系 EOS表达与CCR3蛋白的表达存在着线性关系: 肺组织, r=0.93, P<0.01; 骨髓, r=0.95, P<0.01; 总, r=0.94, P<0.01。EOS表达与CD34蛋白的表达存在着线性关系: 肺组织, r=0.27, P>0.05; 骨髓, r=0.71, P<0.01; 总, r=0.38, P<0.01。CCR3蛋白表达与CD34蛋白的表达存在着线性关系: 肺组织, r=0.28, P>0.05; 骨髓, r=0.6291, P<0.01; 总, r=0.37, P<0.01。 3 讨论 CCR3主要由单一肽链组成的7 个螺旋跨膜结构, 属于G 蛋白藕联受体家族。CCR3 主要表达于EOS上, 介导其迁移及脱颗粒反应, , 在嗜碱性粒细胞、 CD4+T细胞和树突细胞表面仅少量表达。Lamkhioued等2研究报道, CCR3固有表达于骨髓CD34+造血细胞表面。另有文献3报道, 支气管上皮细胞也表达CCR3, 而且与支气管上皮细胞表达的表皮生长因子受体存在交叉干扰。Shannon 等4研究发现eotaxin及eotaxin2通过与CCR3的结合可以诱导部分CCR3内陷和EOS的变形, 有助于EOS的活化和迁移。Joubert等5发现eotaxin 作用于气道平滑肌细胞CCR3可诱导平滑肌细胞迁移和增殖, 使细胞内Ca2+增高。Adachi 等6发现支气管上皮细胞表达CCR3可激活和诱导有丝分裂原激活蛋白（MAP）活化和细胞因子的产生。可见CCR3无论在气道炎症还是重塑方面都起到了重要作用。本实验发现哮喘时不但肺组织EOS浸润明显, CCR3表达增加, 而且黏膜上皮细胞, 平滑肌细胞上CCR3也有明显表达, 平滑肌增厚, 和既往研究一致。 以往研究表明, 在过敏性哮喘患者的骨髓中, 成熟和非成熟的EOS CCR3表达水平显著升高7。Lamkhioued等2研究证实, CCR3可表达于骨髓CD34+造血细胞表面, 在体内外eotaxin与CCR3结合后均表现出明显的趋化活性, 促使骨髓中CD34+细胞产生增多, 只有CCR3-骨髓干细胞转化为CCR3的细胞后, 才可以募集到肺。并且单独或与IL5协同作用可以使骨髓CD34+祖细胞定向分化为EOS, 并向外释放、 募集8, 分化过程中CD34转为CD34-成熟EOS。本实验发现: 一方面, 哮喘组骨髓CCR3及CD34表达明显高于对照组, 与EOS之间互呈线性相关（肺内除外）, 并且CCR3的表达高峰在6 h, 早于CD34+阳性细胞和EOS增加、 释放的高峰时间12 h, 说明在某些因子的作用下, 骨髓祖细胞表达CCR3, 进一步使CD34祖细胞、 EOS分化、 释放增多, 利于炎症的发展。另一方面, 哮喘激发后速发相炎症反应, 肺内CD34阳性细胞, EOS增加, 而骨髓内CD34阳性细胞减少, 血液内EOS减少, 随着时间发展, 迟发相炎症反应出现, 两者逐渐增加。考虑与早期炎症细胞的快速募集大于骨髓产生的速度有关。但是肺内CD34阳性细胞升高后有一下降过程, 后又升高, 考虑为快速募集后的原位造血, 使之消耗, 后来自骨髓的补给使其升高, 同时造成了肺内CCR3及CD34表达与EOS无明显的线性关系。证明在骨髓到外周血再到肺组织存在着密切的细胞信号环路联系。 近年研究的重点倾向于骨髓、 肺组织、 循环之间的细胞信号通路关系, 以便更好地为治疗哮喘开阔思路。如果能切断这方面的环路, 如通过抑制CCR3的表达, 或者给于其拮抗剂抑制CD34表面抗原的表达, 不但切断EOS迁移, 而且切断了CD34造血干细胞的分化、 迁移, 将对哮喘的治疗有很重要的意义。【参考文献】 1 Daudurand RJ, Wang CG, Laberge S, et al. 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