哮喘发作与细胞骨架重建相关基因的差异表达.doc

哮喘发作与细胞骨架重建相关基因的差异表达 作者：蔡绍曦，赵海金，丁彦青，李文军，周斌，肖军 【关键词】 抑制性消减杂交技术；哮喘；嗜酸细胞；细胞支架蛋白质类Differentially expression of genes associated with cytoskeletal remodeling of peripheral blood eosinophils during asthmatic attack【Abstract】 AIM: To determine the differentially expressed genes associated with cytoskeletal remodeling of peripheral blood eosinophils(EOS) in patients during asthmatic attack. METHODS: Doublestranded cDNA was amplified from total RNA of EOS at the time of asthmatic attack and after improvement respectively by Super SMART cDNA Synthesis techology, Suppression subtractive hybridization(SSH) and PCR select differential screening technology were used to detect differentially expressed genes and then differentially expressed genes were sequenced. Homology analysis was conducted by comparing these gene sequences based on GenBank database. RESULTS: Highefficiently upregulated and downregulated subtractive cDNA libraries were constructed successfully; differential screening and homology analysis identified 6 differentially expressed genes associated with cytoskeletal remodeling, including slingshot 2L(SSH2L), PP1 catalytic subunit, beta isoform(PP1C), dedicator of cytokinesis 8(DOCK8), Homo sapiens protein tyrosine phosphatase nonreceptor type 6 and 12(PTPN6, PTPN12), myosin regulatory light chain interacting protein(MIR). CONCLUSION:The differentially expressed genes associated with cytoskeletal remodeling may participate in exacerbation of asthma. Further study on the genes function may provide new gene target for asthma treatment.【Keywords】 suppression subtractive hybridization; asthma; eosinophils; cytoskeletal proteins【摘要】目的： 研究外周血嗜酸性粒细胞(EOS)在哮喘发作时与细胞骨架相关基因的差异表达. 方法： 应用Super SMART cDNA synthesis技术从总RNA合成足量的双链cDNA. 经液相杂交消减两组共同序列，以抑制性PCR方式扩增差异表达序列. 构建上调与下调cDNA文库，菌落PCR扩增差异片段，应用差异筛选技术进一步鉴定差异表达基因并测序，结果通过核酸数据库进行同源性比较. 结果： 构建了高效的上调与下调消减cDNA文库，经鉴定及同源性分析有6个与细胞骨架重建有关，包括上调基因slingshot磷酸酶(SSH2L)，蛋白磷酸酶1亚型(PP1C)，无功能糖基转移酶样蛋白(DOCK8)，蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型6 (PTPN6)与非受体型12(PTPN12)；下调基因，肌凝蛋白调节轻链结合蛋白(MIR). 结论： 这些骨架重建相关基因的差异表达可能参与了哮喘发作，进一步进行功能研究可能为哮喘治疗提供新的作用靶点.【关键词】 抑制性消减杂交技术；哮喘；嗜酸细胞；细胞支架蛋白质类0引言哮喘是一种复杂的多基因遗传病， 病理上是以伴随淋巴细胞与嗜酸性粒细胞（eosinophils, EOS）浸润为主的慢性炎症性疾病. 有证据表明外周血EOS数目与哮喘的症状，一秒用力呼气量（Forced expiratory volume in one second, FEV1）及气道反应性相关，尤其在持续性及重症哮喘，外周血EOS增多与持续性气流阻塞显著、独立相关1-2. 细胞骨架重建在细胞黏附，伸展，运动及细胞内众多信号转导调控等过程中发挥重要作用3. 哮喘患者外周血EOS已经被激活或活化，但其真正分子机制远未清楚，因此我们利用SSH技术研究哮喘患者在发作与缓解时外周血EOS与细胞骨架重建相关基因差异表达，探索其调控分子本质，为哮喘诊治提供帮助.1材料和方法1.1材料分离哮喘患者外周血EOS的Percoll试剂购自瑞典Amersham Pharmacia公司；Trizol总RNA分离试剂购自美国Invitrogen公司；Super SMART cDNA synthesis试剂盒及Chroma spin 1000 depc水纯化柱购自美国Clontech公司. DIG标记和检测试剂为Roche公司DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter Kit I；构建文库的cDNA来自哮喘患者治疗前与缓解时外周血EOS总RNA经Super SMART cDNA synthesis技术合成4.1.2方法1.2.1抑制性消减杂交以治疗前后EOS cDNA互为检测子 (Tester)和驱动子 (Driver). 取纯化Tester及Driver的双链cDNA各2 g，分别用限制性内切酶Rsa 37酶切1.5 h， 酶切完全后鉴定酶切效率. SSH其他过程按照SSH试剂盒说明及参考文献5进行.1.2.2差异基因片段分离将第二次PCR产物纯化并定量，混合1 L(100 ng)及3 L (155 ng)纯化后的PCR产物及1 L PBSTT载体(50 mg/L)，在1 L T4 DNA连接酶作用下，12连接16 h. 取2 L连接质粒与50 L感受态细胞DH5混匀，用Cacl2将质粒导入大肠杆菌. 取100 L转化菌液均匀涂布于Xgal, IPTG的氨苄青酶素琼脂培养板上，37过夜培养. 随机挑取100株白斑菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，置37培养箱中，250 r/min振摇过夜，重复实验直至获得250株转化菌.1.2.3目的基因片段的获取转化菌株进一步分别以接头1和接头2R的内、外侧序列为引物，进行菌落PCR扩增，参数： 94 30 s, 68 30 s, 72 2 min, 20循环后电泳分析.1.2.4差异筛选鉴定差异表达基因采用PCRselect 差异筛选技术对目的片段进行杂交鉴定. 实验步骤严格按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I试剂盒说明书进行.1.2.5测序及同源性分析进一步用巢式 PCR确认质粒内差异片段，然后纯化质粒，测序由上海博亚公司协助完成，编码序列提交美国国立医学图书馆GenBank数据库进行同源性比较.2结果2.1酶切及连接效率酶切后经1.5 g/L琼脂糖/EB凝胶电泳分析，表现为平均大小在 0.12.0 kb之间的条带，说明cDNA酶切较完全. 接头序列引物与G3PDH3引物扩增产物的灰度值较G3PDH5, 3引物所得产物的灰度值比值大于50%，说明连接效率较高.2.2消减杂交效率用G3PDH基因特异性引物分别扩增两次消减杂交前后的cDNA产物(图1)，经消减杂交的cDNA 33循环可见扩增产物，而未消减在18循环就可见，说明杂交效率较高.2.3目的基因片段的电泳以转化菌株重组质粒为模板行PCR扩增目的基因片段，结果采用1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，显示目的基因片段分子质量分布范围均在200800 bp，250个菌株扩增获得阳性目的基因片段 228个，阳性率达91.2%.M: 1000 bp DNA Marker；1, 5: 18 循环；2, 6: 23 循环；3, 7: 2 8循环；4, 8: 33循环.图1消减杂交效率分析（略）M: 1000 bp DNA Marker；1, 5: 18 循环；2, 6: 23 循环；3, 7: 2 8循环；4, 8: 33循环.图2目的基因片段的电泳分析（略）2.4序列分析及同源性对确定的12个阳性克隆测序后，通过BLAST进行同源性比较，经查阅文献共确定6个与细胞骨架重建相关的基因，分别为上调基因SSH2L, PPP1C, DOCK8, PTPN6及PTPN12；下调基因MIR(表1).表1哮喘治疗前后EOS 差异cDNA克隆同源性比较（略）P: 上调表达基因；R: 下调表达基因.2.5消减cDNA文库的筛选采用PCRselect 差异筛选技术对72个目的基因(包括45个上调表达克隆与27个下调表达克隆)进行进一步鉴定，根据Clontech公司提供的参考标准确定真正差异表达克隆.3讨论哮喘的发作和分子病理学过程是由于多种类型细胞特异性基因的表达变化决定的，对常见疾病哮喘进行基因表达的分析，可帮助寻找疾病诊断与疗效判断的分子靶点. 本研究应用Super SMART cDNA synthesis 技术与SSH技术，经测序、同源性比对及文献查询，初步证实了6条在哮喘发作期与EOS细胞骨架重建相关基因差异表达.细胞骨架在物质运输、白细胞的迁移及基因表达等方面起着重要作用. 肌动蛋白结合蛋白(ADP/confilins)家族是影响肌丝重建的关键因素. 高度活化的cofilins 促进细胞产生片足及可决定细胞运动方向6. EOS从外周血向肺组织迁移是过敏性哮喘的重要特点，EOS迁移也依赖于细胞骨架的调节.我们的初步研究结果提示： 上调基因SSH2L属于酪氨酸磷酸酶亚类之一，SSH在cofilins去磷酸化上发挥关键作用7. 本研究SSH2L在EOS表达升高，可加快EOS内肌动蛋白快速组装，促进细胞迁移，趋化，跨膜运动，可能是EOS内重要的分子调控机制. 下调基因MIR可以被多种因素所调节，MIR可以通过泛素化作用降低肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)功能，其在EOS表达的下调可能使其抑制肌球蛋白功能作用下降，从而促进马达蛋白活性，可能参与EOS的趋化调节. 蛋白磷酸酶1(PP1)参与调控糖代谢，基因表达，细胞分化等. 果蝇PP1可以调节非肌细胞肌球蛋白，如果缺失PP1功能会导致MLC磷酸化水平升高及肌动蛋白结构破坏8. PP1在EOS表达的增高可能通过cofilin，肌球蛋白及微管等途径引起细胞骨架重建. DOCk8是一种潜在的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF), GEF可以激活某些小分子鸟苷三磷酸酶. DOCK8参与细胞内具体作用机制尚不清楚，可能通过介导Rho激酶家族某一成员参与协调细胞骨架运动. 蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase, PTPase）是一个多基因家族，主要分为受体和非受体样PTPase两类，PTPase参与多种激素（如胰岛素等）介导的信号转导、细胞增殖和促进MHCI类抗原表达. PTPN6属于PTPase家族成员之一，主要在血细胞发育，增生及受体介导的丝裂原信号转导通路发挥作用. PTPN12也是PTPase家族成员之一， PTPN12可以参与蛋白与蛋白相互作用，与细胞内蛋白半衰期有关，可以去磷酸化众多细胞骨架蛋白及细胞粘附分子，参与控制细胞的形态及运动9.【参考文献】1 Brinke AT, Zwinderman AH, Sterk PJ, et al. Factors associated with persistent airflow limitation in severe asthmaJ. Am J Respir Crit Care Med, 2001,164（5）:744-748.2 Bumbacea D, Campbell D, Nguyen L, et al. Parameters associated with persistent airflow obstruction in chronic severe asthmaJ. Eur Respir J, 2004,24(1):122-128.3 Samstag Y, Eibert SM, Klemke M, et al. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migrationJ. J Leukoc Biol, 2003,73(1):30-48.4 赵海金，蔡绍曦，邹飞,等. 应用Super SMART cDNA synthesis技术扩增哮喘嗜酸性粒细胞RNAJ. 第一军医大学学报,2004,24(9):1037-1039.5 陈军，范清宇，张惠中，等. 应用抑制性消减杂交技术筛选成骨肉瘤转移相关基因J. 第四军医大学学报,2003,24(15):1376-1378.6 Ghosh