儿童急性淋巴细胞白血病核转录因子κB的表达及其意义.doc

儿童急性淋巴细胞白血病核转录因子B的表达及其意义 作者：薛天阳, 许伟, 安琪, 武怡, 徐春萍, 张晓艳【摘要】 为了探讨儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）NFB P65蛋白的表达及意义，应用SP免疫组织化学法检测32例ALL患儿和40例非血液病的对照儿童NFB P65蛋白的表达。结果表明： 32例ALL患儿的NFB P65蛋白的阳性表达率为87.50%（28/32），表达定位于ALL细胞的胞核及胞浆中，阳性表达率明显高于对照组12.50%（5/40），两者比较有显著性差异（240.28， p0.01）。在28例ALL患儿组阳性表达者中，弱阳性表达（+）占10.71%（3/28），阳性表达（+）占42.86%（12/28），强阳性表达（+）占46.43%（13/28）。正常对照组均为弱阳性表达（5/5），两者表达程度经Ridit分析差异有显著意义（p0.01）。ALL病程间（初发或复发）、免疫表型间（T系ALL与B系ALL）、各细胞形态学间的表达程度差异均无显著意义（p0.05，四格表精确概率法）。结论： NFB P65蛋白表达于儿童ALL细胞中，抑制NFB信号传导途径可能在儿童ALL治疗中有重大价值，这为临床寻求以NFB为靶点的治疗手段提供了科学依据。 【关键词】 核转录因子B Expression of Nuclear Transcription Factor B in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia and Its Significance Abstract To investigate the expression of nuclear transcription factor B(NFB) in childhood acute lymphoblastic leukemia(ALL) and its significance, the biotinstreptavidin method and microscopy were used to detect NFB P65 protein in cells from 32 childhood ALL patients and 40 children without hematologic malignancies as control. The results showed that the positive expression rate of NFB P65 protein in cells from 32 childhood ALL patients was 87.50%, obviously higher than that in control group (12.50%) (240.56， p0.01). In 28 childhood ALL patients with positive expression， the ratio of weakly positive（+） cases to all positive cases was 10.71%（3/28）; the ratio of generally positive（+） case was 42.86%（12/28）， and the ratio of strongly positive（+）cases was 46.43%（13/28）. While in the control group the of NFB P65 protein showed low expression with 100%（5/5）. There was significant difference in the level of NFB P65 protein between ALL patients and control group. While the level of NFB P65 protein had no significent difference in morphology, immunophenotype （Tlineage ALL and Blineage ALL） and the courses in the de novo and the relaspsed cases. It is concluded that NFB P65 protein expresses in cells of childhood ALL, the inhibition of NFB transduction pathway may have significant value in childhood ALL treatment. This study provides experimental basis concerning clinical treatment for ALL, when NFB is taken as a target. Key words NFB; NFB P65 protein; acute lymphocytic leukemia J Exp Hematol 2007; 15(4):767-771 目前认为核转录因子B（nuclear transcription factor B, NFB）在肿瘤的发生、发展中起重要作用。我们采用SP免疫组织化学法检测32例急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿和40例正常儿童NFB P65蛋白的表达，以探讨儿童ALL NFB P65蛋白表达的意义，为临床寻求以NFB为靶点的治疗手段提供科学依据。 材料和方法 临床资料 32例急性淋巴细胞白血病患儿为2003年1月-2006年5月徐州医学院附属医院儿科及徐州市儿童医院的住院患儿，其中男22例，女10例；年龄1岁3个月-13岁，中位年龄6.2岁。按细胞形态学分类： L1型21例、L2型6例、L3型4例、淋巴肉瘤白血病1例。按免疫表型分类： T细胞型ALL 5例， B细胞型ALL 27例。按病程分类： 26例为初发病例，6例为复发病例。诊断标准均按照2006年小儿急性淋巴细胞白血病诊疗建议1，所有患儿实验前至少2周未用任何化疗药物，至少1周未用过抗生素。对照儿童来自徐州医学院附属医院儿童外科手术患儿，年龄、性别与急性淋巴细胞白血病患儿相匹配，共40例，其中男23例，女7例；年龄1岁2个月-14岁，中位年龄6.8岁，对照患儿疾病种类有腹股沟斜疝、鞘膜积液、脂肪瘤、先天性斜颈、直肠息肉、先天性心脏病等。采血均在手术前进行。这40名对照儿童均无血液病史及其他肿瘤史，实验前1周无服药和感染史。 一抗(小鼠抗NFB P65单克隆抗体)购于Santa Cruz公司，SP免疫组织化学试剂盒和浓缩型DAB试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供，淋巴细胞分离液购于华美生物工程公司。 实验方法 取患儿化疗前骨髓2 ml或外周血4 ml（WBC20.0109/L，幼稚细胞60），分离单个核细胞，取50 l细胞悬液滴于防脱胶（10%的多聚赖氨酸）处理的玻片上或骨髓直接涂片（幼稚细胞占0.80以上），自然干燥，冷丙酮固定10分钟。对照组以同法制备标本。用SP免疫组织化学法检测NFB P65蛋白表达率。 SP免疫组织化学检测 细胞涂片或滴片经冷丙酮固定10分钟后，用PBS冲洗3分钟，3次。3%过氧化氢孵育20-30分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。用蒸馏水冲洗，以PBS浸泡5分钟。滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10-15分钟，倾去，勿洗。滴加150比例稀释的一抗（小鼠抗人NFB P65单克隆抗体），同时以PBS代替一抗作为阴性对照，4过夜。用PBS冲洗3分钟，3次。滴加二抗（生物素标记羊抗小鼠工作液），37孵育10-15分钟。用PBS冲洗3分钟，3次。滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37孵育10-15分钟。用PBS冲洗3分钟，3次。DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，苏木素复染，封片。 结果判定 显微镜下细胞质和细胞核均出现棕黄色颗粒为NFB P65亚单位表达的阳性细胞。油镜下计数至少500个细胞，阳性细胞数5%为(-)；5%-25%为(+)；25%-50%为(+)；50%为(+)。 统计学处理 数据由SPSS统计软件处理： SP免疫组织化学实验结果应用2检验、校正2检验、四格表精确概率法分析。实验数据以均数标准差（ SD）表示。检验水准=0.05， p0.05为统计学差异有显著性。 结 果 NFB P65蛋白在儿童ALL细胞中的表达 细胞质和细胞核均出现棕黄色颗粒为NFB P65蛋白表达阳性细胞。阴性对照无着色（图1）。NFB P65蛋白的表达及表达程度的分布见表1。对照组骨髓/外周血单个核细胞NFB P65蛋白阳性表达率为12.50%（5/40）。 ALL患儿组阳性表达率为87.50%（28/32），明显高于对照组，两者比较有显著性差异（240.28， p0.01）。在ALL患儿组 Figure 1. Positive expression of NFB P65 protein in nuclear and cytoplasm of childhood ALL cells. A: positive expression of NFB P65 protein（+）(DAB staining100). B: positive expression of NFB P65 protein（+）(DAB staining400). C: positive expression of NFB P65 protein（+）(DAB staining100). D: positive expression of NFB P65 protein（+）(DAB staining100). 阳性表达者中，弱阳性表达（+）占10.71%（3/28），阳性表达（+）占42.86%（12/28），强阳性表达（+）占46.43%（13/28）；对照组均为弱阳性表达（5/5），两者阳性表达程度经Ridit分析差异有显著意义（p0.01）。 NFB p65蛋白表达在儿童ALL病程、免疫表型、各细胞形态学方面的差异 初发ALL患儿中NFB p65蛋白的阳性表达率为84.62%（22/26），其中弱阳性表达占13.64%（3/22），阳性表达占45.45%（10/22），强阳性表达占40.91%（9/22）；复发ALL患儿NFB p65蛋白阳性表达率为100.00%（6/6），其中弱阳性表达为0，阳性表达占33.33%（2/6），强阳性表达占66.67%（4/6）。初发与复发ALL两者阳性表达率比较，经四格表精确概率法检验无显著性差异（p= 0.566）。 T系ALL患儿中NFB p65阳性表达率为80.00%（4/5），其中阳性与强阳性表达各占50.00%（2/4）；B系ALL NFB p65阳性表达率为88.89%（24/27），其中弱阳性表达占20.83%（5/24），阳性表达占37.50%（9/24），强阳性表达占41.62%（10/24）。T系ALL与B系ALL患儿两者阳性表达率比较，经四格表精确概率法检验无显著性差异（p =0.512）（表2）。 L1型ALL NFB p65阳性表达率为85.71%（18/21），其中弱阳性表达占16.67%（3/18），阳性表达占38.89%（7/18），强阳性表达占44.44%（8/18）；L2型ALL NFB p65阳性表达率为83.33%（5/6），其中弱阳性表达占40.00%（2/5），阳性表达占60.00%（3/5），强阳性表达为0；L3型ALL NFB p65阳性表达率为100.00%（4/4），其中弱阳性表达为0，阳性与强阳性表达各占50.00%（2/4）；淋巴肉瘤白血病阳性表达率为100.00%（1/1）。从ALL各细胞形态学间看NFB p65蛋白表达程度经四格表精确概率法检验差异无显著意义（p0.05）（表3）。 讨 论 NFB是1986年Sen和Baltimore2首先从成熟B淋巴细胞核抽提物中发现的。它是一种能与免疫球蛋白轻链基因增强子B序列（5GGGACTTTCC3）特异性结合，调节其基因表达的核蛋白因子称之为NFB。随后的研究表明，NFB几乎存在于所有类型的细胞中。NFB的生物学功能十分广泛，参与炎症、免疫、应激等众多基因的表达调控。最近研究发现NFB在肿瘤的发生、发展中起重要作用，它可调控细胞的增殖、分化、凋亡与恶性转化3。 目前对于成人肿瘤组织中NFB的活化与作用研究较多，但是有关儿童ALL中NFB的组成性活化国内外研究甚少。本研究中主要采用免疫组织化学方法检测儿童ALL细胞NFB P65 蛋白的表达，以探讨NFB在儿童ALL发病中的作用和意义。我们的研究结果显示：在大部分儿童ALL细胞中（17/20）存在有NFB的表达 ，且多为阳性-强阳性（+-+）表达，与对照儿童相比，差异有显著意义。崔龙等4研究认为，当多种刺激引起NFB组成性活化时，只有10-20的Rel A可易位进入细胞核，而80%-90%的Rel A仍存留于细胞质中。而NFB P65单克隆抗体不仅识别活化后存在于细胞核中的Rel A，也能识别活化后存在于细胞质中的Rel A，因此NFB组成性活化的细胞胞质和胞核均出现阳性染色。我们的研究结果与此相符，在ALL阳性细胞细胞质和细胞核均出现阳性染色。 Kordes等5用EMSA方法研究发现，大多数（39/42）儿童ALL细胞中存在NFB的组成性活化，并且NFB的这种活化对佛波酯（phorbol12myristate13acetate，PMA）刺激无反应，提示NFB的活性达到最大。Kordes的研究还发现ALL细胞NFB的组成性活化与其免疫表型、疾病初发或复发、泼尼松试验均无关。因而认为NFB的组成性活化为儿童ALL的一个特异性特征。 在本研究中，我们的结果显示：初发与复发ALL之间、B系ALL与T系ALL之间、ALL细胞形态学分型之间NFB P65蛋白的阳性表达率及表达程度的分布均无显著性差异。因此，我们的研究结果与Kordes的研究结果相似，均提示NFB的组成性活化与疾病原发或复发、免疫学分型无关。由此我们进一步推测，NFB的组成性活化可能是儿童ALL的一个特异性特征，NFB可能在儿童ALL的发生、发展中起重要作用。 儿童ALL细胞中NFB异常激活的机理尚未完全明了，有以下3种可能6：NFB的上游信号过度激活或其抑制蛋白IB突变，继而导致NFB的异常激活；病毒蛋白（如EBV、HIV）可激活NFB；并且在某些情况下，病毒蛋白诱导的NFB活化是病毒致瘤作用所必需的；一些癌蛋白如Ras可激活NFB。Kordes等5研究发现，野生型的重组IB的DNA结合反应可以阻断P65P50的活化，因而认为NFB的组成性活化并非由其抑制蛋白IB突变导致。那么，儿童ALL细胞中NFB的组成性活化究竟是由其上游信号过度激活导致？还是由其他两种因素导致？这问题有待进一步的研究。 NFB的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。当被异常激活时，细胞正常的信号传导被改变，从而促进细胞癌变，参与肿瘤的形成发展。因此，临床上如果抑制其过度活化，便可达到治疗肿瘤的目的。 至于NFB的组成性活化在肿瘤细胞中的确切作用，至今还不明了。目前认为，NFB P50P65可能通过上调促细胞存活基因表达，或抑制促凋亡基因，或活化持续性正性生长信号，从而保护细胞免于凋亡7、8。NFB还可通过调控细胞黏附分子、组织纤溶酶原激活物、细胞周期蛋白等的转录表达而参与肿瘤的形成发展。Bargou等9的研究证实，抑制NFB的活性，确实能够增加霍杰金氏病ReedSternberg细胞的凋亡率和减少其增殖。体外实验已经证明，NFB抑制剂PS341有抗多发性骨髓瘤细胞的作用。至目前为止PS341已进入期临床试验10。由此可知，NFB已成为治疗肿瘤的一个理想的靶分子11。【参考文献】 1顾龙君. 儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第三次修订草案）. 中华儿科杂志, 2006；44:392-3952Sen R, Baltimore D. Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences. Cell, 1986； 46:705-7163Attar RM, Caamano J, Carrasco D, et al. Genetic approaches to study Rel/NFkappa B/I kappa B function in mice. Semin Cancer Biol, 1997；8:93-1014崔龙,陈雪华，林言箴等. 腺病毒载体介导的自杀基因对MFC小鼠前胃癌细胞的体外杀伤作用. 外科理论与实践,2000；5:167-1695Kordes U, Krappmann D, Heissmeyer V, et al. Transcription factor NFkappa B is constitutively activated in acute lymphoblastic leukemia cells. Leukemia, 2000；14:399-4026Jo H, Zhang R, Zhang H, et al. NFkappa B is required for Hras oncogene induced abnormal cel