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人表皮细胞中侧群细胞表型的初步分析 作者：程俊美任宁曾庆东施娟红李劲松【摘要】 目的：检测人表皮细胞中是否存在侧群(side population，SP)细胞，并研究该表型细胞是否表达通用干细胞标志物ABCG2和表皮干细胞的标志物整合素6和1。方法：运用中性蛋白酶和胰蛋白酶两步消化法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮细胞。经Hoechst33342荧光染料和PI染色，流式细胞仪分析并分选SP细胞。采用流式细胞仪分析SP细胞ABCG2、整合素6和1的表达情况。结果：人表皮细胞中存在SP细胞，其比例为0.2%0.3%。用流式细胞仪可检测到在SP细胞以及总表皮细胞中均有少量细胞表达通用干细胞标志物ABCG2以及表皮干细胞的标志物整合素6和1，但二者阳性细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)。结论：表皮细胞中的SP细胞是否是富集的表皮干细胞仍存在疑问，还需要进一步的动物体内移植实验、克隆形成能力和增殖能力的研究证实。 【关键词】 侧群细胞表皮干细胞ABCG2整合素6整合素1【ABSTRACT】 Objective: To explore side population(SP) cells in human epithelial cells and to observe the expression of the universal stem cell marker ABCG2, epidermal stem cell markers 6 integrin and 1 integrin on SP cells. Methods: Epithelial cells were obtained by digesting human skins with Dispase II and Trypsin and stained with Hoechst33342 and PI. The SP cells were analyzed and sorted by the fluorescence-activated cell sorter. Then the expression of ABCG2, 6 integrin and 1 integrin was analyzed by flow cytometry. Results: SP cells accounted for 0.2%-0.3% of total human epithelial cells. Only a small part of cells expressed ABCG2, integrin 6 and integrin 1 of both SP cells and total human epithelial cells detected by flow cytometry .The difference of positive rates between SP cells and total human epithelial cells was not significant. Conclusion: SP cells accounted for 0.2%-0.3% of total human epithelial cells. The difference of positive rates of stem cells marker ABCG2, integrin 6 and integrin 1 between SP cells and total human epithelial cells was not significant.【KEY WORDS】 Side population Epidermal stem cells ABCG2integrin 6 integrin1侧群 (side population，SP) 细胞是利用Hoechst荧光染料和流式细胞术进行造血干细胞分离时发现的一群特殊细胞，高表达干细胞标志物ABCG2 (ATP-binding cassette superfamily G member 2)1。SP细胞既具有类似干细胞的自我更新和多向分化潜能，还具有独特的表型标记和生物学特征，代表了一种新的干细胞类型2。已有越来越多的研究者将SP细胞分离法用于对干细胞的分离中。皮肤是始终处于不断更新状态的组织之一，这种不断的更新是由位于表皮基底部和毛囊隆突部的表皮干细胞维持的。表皮干细胞在创伤修复和维持内环境稳定过程中具有重要作用，而且是肿瘤发生和基因治疗的主要靶标3。本研究利用SP细胞分离法检测人表皮细胞中是否存在SP细胞，并研究该表型细胞是否表达通用干细胞标志物ABCG2、表皮干细胞标志物整合素6和1，为进一步研究SP细胞提供线索和基础。1资料与方法1.1一般资料收集山东大学齐鲁医院普外科2008年1月2008年10月56例腹部手术患者的腹部皮肤组织。1.2主要试剂与仪器K-SFM培养基、维拉帕米(Gibco公司)，小牛血清(Hyclone公司)，中性蛋白酶、0.25%胰酶(Gibco公司)， Hoechst33342荧光染料、PI(碘化丙锭，Sigma公司)，小鼠抗人ABCG2-FITC、 CD71-PE、6-FITC单克隆抗体(Sigma公司)，羊抗人1-FITC单克隆抗体(millipore公司)，同型对照抗体IgG1-FITC、IgG1-PE(Sigma公司)。超净工作台(Air Tech公司)，超速离心机(Sigma公司)，CO2恒温细胞培养箱(Heraeus公司)，FACSAria流式细胞仪(BD公司)。1.3实验方法1.3.1表皮细胞悬液制备无菌条件下取患者腹部皮肤、彻底清洗，去除皮下组织，将皮肤剪切成约0.5 cm1.0 cm大小的皮片，中性蛋白酶消化，4 过夜。D-Hanks清洗，仔细分离表皮和真皮层，将表皮剪碎，加0.25 %胰酶，室温孵育8 min，用含血清培养基终止消化，过200目筛网，1 000 r/min离心6 min;用K-SFM培养基重新悬浮细胞，吹打成单细胞悬液。1.3.2细胞染色和SP细胞分选取表皮单细胞悬液，用K-SFM培养液重悬成1106 mL-1的细胞悬液，加入Hoechst33342至终浓度为5 g/mL。另取同一标本相同量表皮单细胞悬液加入Hoechst33342至终浓度为5 g/mL，同时加入维拉帕米至终浓度为50 g/mL，做为对照组。37 水浴90 min，离心，弃上清。 D-Hanks清洗1次，重悬于含2%小牛血清的PBS缓冲液中，加入PI至终浓度为2 g/mL，上流式细胞仪分选SP细胞。Hoechst33342的激发光为407 nm紫光， 450/40带通收集蓝光， 695/40带通和655长通收集红光。PI的激发光为488 nm蓝光，用575/26带通收集红光。1.3.3流式细胞仪分析收集同一标本总表皮细胞和分选的SP细胞，每106 个细胞分别加入5 L小鼠抗人ABCG2-FITC单克隆抗体，4 室温避光孵育30 min，D-Hanks液清洗后待检测，阴性对照管为IgG1-FITC。采用同样的方法分别用小鼠抗人6-FITC、CD71-PE单克隆双抗体(阴性对照管IgG1-FITC/IgG1-PE)和羊抗人1-FITC单克隆抗体(阴性对照管为IgG1-FITC)对2种细胞进行荧光抗体标记后，上流式细胞仪分析。1.4观察项目根据阴性对照确定标本是否为阳性，Cellquest软件自动分析阳性率。1.5统计学处理采用SPSS13.0统计软件包进行分析，SP细胞和总表皮细胞ABCG2、整合素6和1阳性表达率结果的记录方式为至少3次独立重复结果，记录为xs，数据进行u检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1SP细胞分选结果表皮细胞染色后先经过前向角和测向角散射光分析，去除左下角细胞碎片。PI染色分为PI阴性活细胞和PI阳性死细胞2群，去除死细胞。收集状态良好的活细胞，分析Hoechst33342蓝光和红光的双参数图，SP细胞位于左下角2种荧光均阴性或很弱的区域。无维拉帕米组SP细胞比例约为0.2%0.3% (图1A)，对照组经维拉帕米阻断后SP细胞比例减少(<0.01%，图1B)。2.2流式细胞仪分析SP细胞ABCG2、整合素6和1表达流式细胞仪检测到SP细胞和总表皮细胞中ABCG2阳性细胞数均较少(图2)。SP细胞和总表皮细胞中均有少数6briCD71dim细胞和整合素1阳性表达细胞(图3、4)。2种细胞中ABCG2、6briCD71dim细胞和整合素1阳性表达率比较见表1。通用干细胞标志物ABCG2、表皮干细胞标志物整合素6和整合素1在SP细胞和总表皮细胞中的阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。3讨论在干细胞表型标记和功能特性研究中，人们利用Hoechst荧光染料结合荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)进行造血干细胞的分析时，发现一群分布特殊的细胞，经过紫外激发后用双波长(450 nm和675 nm以上波长)检测，可以观察到这群细胞发出微弱的蓝色和红色荧光，在流式二维分析点阵图上，呈彗星状分布在造血干细胞主群的一侧，被称为SP细胞1，这已成为一种常用的分离造血干细胞的方法。在成体多种组织，如肝、肺、脑、神经、小肠、气管等中都发现了SP细胞，SP细胞具有自我更新和多向分化潜能，在体内能够分化产生不同组织类型的细胞，很多学者认为其代表了一群新型干细胞，并将其称为侧群干细胞4。对SP细胞的研究有助于增加对干细胞各种特性的理解，还提供了一种从组织细胞中分离纯化和利用干细胞的策略。表皮干细胞的分离与鉴定对机体稳态维持、创伤愈合以及癌症等研究起着重要作用。目前，表皮干细胞的分离方法有标记滞留法、克隆分析法、分子标记法5-7。但由于操作繁杂而不易分离，加上表皮干细胞数量较少，且缺乏特异性分子标志，为其研究带来了一定困难。因此，本研究采用不依赖分子标记的Hoechst33342染色结合FACS分析人表皮细胞中是否存在干细胞样的SP细胞。Triel等8采用人(455岁)胸部及耳部皮肤检测到表皮细胞中SP细胞比例分别为0.01%5.39%、0.08%2.01%，并得出SP细胞比例与部位无相关性的结论。本研究采用人腹部皮肤作为表皮细胞来源，经消化分离获得表皮细胞，结果显示人皮肤的表皮细胞中存在SP细胞，比例为0.2%0.3%。范围小于Triel等8的结果，可能与皮肤供者年龄范围较窄有关。ABC转运蛋白(ATPbinding cassette transporter)是一类跨膜蛋白超家族，参与了多种物质分子的“出”、“入”细胞的跨膜转运过程，能选择性地把一些染料(如Hoechst33342)和药物泵出细胞外，其成员包括MDR1、ABCG2、ABCA3等9。多数研究认为高表达ABC转运蛋白是产生SP表型的原因，提示ABCG2可作为SP细胞的表型标志而用于分离鉴定10。ABCG2能够被钙离子拮抗剂维拉帕米非特异性阻断，抑制染料外排，减少SP细胞比例。本研究在对照组中加入维拉帕米后可见SP亚群明显减少，与Goodell等1的研究结果相符。但流式细胞仪分析结果显示，与总表皮细胞相比，SP细胞ABCG2表达并不增高。近来，Zhou 等11通过一系列研究证实ABCG2和MDR1均表达于造血干细胞， 并证实维拉帕米不仅可以阻断ABCG2，还可阻断MDR1。所以SP细胞外排Hoechst染料并不只与ABCG2表达有关，应该还有其他的转运蛋白参与，还需进一步研究证实。整合素是一类位于细胞膜表面的糖蛋白受体超家族分子，由和两种亚单位组成。表皮基底细胞主要表达21、31和64。整合素不仅介导表皮干细胞与细胞外基质的黏附，也调控终末分化启动。Jones等7发现整合素1高表达的表皮细胞富含表皮干细胞。Tani等12研究证实， 使用整合素6和另一个表皮细胞的表面标志CD71来区分表皮干细胞、暂时增殖细胞和终末分化细胞更有优势。通过6和CD71 可以将表皮细胞分为3 种类型，其中6briCD71dim细胞约占细胞总数的8%，这类细胞代表表皮干细胞。因此，高表达整合素6也被认为是表皮干细胞的表面标志之一。本研究显示SP细胞中存在6briCD71dim细胞和整合素1阳性表达细胞;总表皮细胞中6briCD71dim细胞比例和整合素1阳性表达率与Jones等7和Tani等12的研究结果一致;但是与总表皮细胞相比，SP细胞表达整合素6和1并不增高。这与Triel等8的研究结果一致。Jones等7已证实高表达整合素6和1是表皮干细胞的标志，而SP细胞整合素6和1表达不增高，因此Triel等8认为表皮细胞中SP细胞可能不是表皮干细胞。本研究认为，虽然SP细胞并不高表达通用干细胞标志物ABCG2、表皮干细胞标志物整合素6和整合素1，但还需要进一步的动物体内移植实验检测SP细胞的克隆形成能力和增殖能力以及在维持皮肤内环境稳定中的作用，才有可能明确表皮细胞中SP细胞是否是富集的表皮干细胞。【参考文献】 1 Goodell MA, Brose K, Paradis G, et al. 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