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sFGFR1基因的克隆与在RTS系统中的高效表达 作者：陈勇，崔大祥，孙凯，杨雁灵，戴辉 【关键词】 成纤维细胞生长因子 【Abstract】AIM： To clone sFGFR1 gene and express corresponding protein in RTS. METHODS: Swiss rat 3T3 fibroblasts were cultured, total RNAs were extracted and sFGFR1 cDNA was obtained by RTPCR. The fragments were cut by means of NcoI and SmaI and products were cloned into pIVEX23 d vector and sequenced. SFGFR1 protein was expressed by using RTS ProteinMaster 500 and products were analyzed by Western Blot. RESULTS: sFGFR1 gene was cloned and sequencing analysis confirmed the cloned sequence was correct. Western Blot results confirmed sFGFR1 was highly expressed. CONCLUSION: sFGFR1 gene is cloned and highly expressed in RTS. 【Keywords】 receptors, fibroblast growth factor;cloning, molecular; rapid translation system;gene expression 【摘 要】目的： 克隆sFGFR1(soluble fibroblast growth factors receptor1)基因，并在RTS(rapid translation system)系统中高效表达相应蛋白.方法： 培养Swiss rat 3T3 fibroblast 细胞株，提取总RNA，用RTPCR方法获取鼠sFGFR1 cDNA片段,酶切后克隆到pIVEX2.3 d载体并进行序列分析；采用Roche RTS ProteinMaster 500 系统，高效表达sFGFR1蛋白并用Western Blot 鉴定表达的蛋白.结果： 克隆了sFGFR1基因，测序证实序列正确；Western Blot证实sFGFR1蛋白在RTS系统中高效表达.结论：克隆了sFGFR1基因并在RTS系统获得高效表达. 【关键词】 受体，成纤维细胞生长因子；克隆，分子；RTS；基因表达 0 引言 器官移植的预后与机体免疫排斥反应程度密切相关.目前研究表明，FGF1与FGF2在出现慢性排斥反应的移植肾脏、心脏或皮肤等组织中呈强烈地高表达，与移植物因慢性排斥所造成的移植器官内血管进行型硬化AGA（accelerated graft arteriosclerosis, AGA）的产生成正相关1-3.目前对慢性排斥反应尚无有效治疗手段.采用转基因技术，高效表达可溶性成纤维细胞生长因子受体sFGFR1蛋白，有可能阻断FGF 对血管内膜增生的刺激作用，从而抑制AGA形成.我们研究克隆并高效表达了sFGFR1（soluble fibroblast growth factor receptor1,sFGFR1），为进一步研究sFGFR1在抑制慢性排斥反应中的作用奠定基础. 1 材料和方法 1. 1 材料 鼠3T3细胞株本室保存.pIVEX2.3 d 载体，RTS 500 E.Coli HY Kit与 RTS ProteinMaster 500设备及配套试剂购自Roche Life Science 公司.NcoI 与SmaI 酶购自England Biolab 公司.FGFR1 抗体购自Cambridge Antibody 公司.其他试剂购自Germany Merck公司.PCR 引物由崔大祥博士设计，由 MWG Life Science Company 合成.上游引物：5GTC CCATGG TGGGATGTGGGGCTGGAGG3,下游引物：5GCGC CCCGGG TATTCCAGGTACAGASGGTGAGGT3,含有NcoI 与SmaI酶切位点. 1.2 方法 1.2.1 细胞培养、总RNA的提取与RTPCR反应 常规培养鼠3T3细胞株，采用总RNA提取试剂盒提取总RNA，用无RNA酶的DNA酶除去可能残余的DNA，用下游引物作起始引物，进行反转录，条件为：10Reverse Transcription Buffer 2 mL, 10 mmol・L-1 dNTPs 2 mL, RNasin inhibitor 05 mL, MgCl2 4 mL, Primer2 1 mL,Total RNA 6 mL, FreeRNase water 4 mL,AMV Reverse Transcriptase 1 mL,Total volume 20 mL.室温 10 min, 42 60 min, 75 5 min. PCR反应：10PCR Buffer 3 mL, 25 mmol・L-1 dNTPS 3 mL, primer1 1 mL, primer2 1 mL,反转录产物4 mL, H2O 17 mL, Taq酶1 mL, 总体积30 mL.PCR反应条件：94 35 s ,55 50 s ,72 55 s ,30个循环，最后在72延伸10 min.产物进行12 g・L-1琼脂糖电泳. 1.2.2 PCR产物的酶切、回收与克隆 PCR产物4 mL,1Buffer A 16 mL,SmaI 20 U,25 1 h.加入20 U的NcoI酶在37消化1 h.加入2 mL 05 mol・L-1 EDTA终止反应.产物进行12 g・L-1琼脂糖凝胶电泳，用回收试剂盒回收目的片段.同样条件酶切pIVEX23 d质粒，回收酶切产物.常规连接、转化Ecoli.DH5a大肠杆菌，提取质粒并酶切鉴定. 1.2.3 测序与在RTS系统中高效表达 含有sFGFR1基因的克隆质粒，送交MWG公司测序.按照RTS 500 Ecoli.HY Kit 说明，取适当混合物，直接加入克隆的含有sFGFR1的pIVEX23 d质粒，混匀后在RTS ProteinMaster 仪器上反应4 h. 1.2.4 Western Blot 鉴定 取10 mL产物进行60 g・L-1浓缩胶，120 g・L-1 分离胶的SDSPAGE凝胶电泳，转印到PVDF膜上，用鼠血清封闭后，加入一抗30 min，再加入二抗，AKP底物常规显色. 2 结果 2.1 RTPCR 结果 sFGFR1基因片段用RTPCR方法获取(Fig 1)，大小为28 kb. 1：PCR marker; 2,3,5： sFGFR1 fragment; 4：Negative control. 图1 RTPCR 结果（略） Fig 1 Result of RTPCR（略） 2.2 酶切鉴定结果 克隆质粒被酶切电泳后，证实所插入片段大小为850 bp，与预期相符(Fig 2). 1: DNA Hind marker; 2: Products cut with enzymes; 3: Plasmid with sFGFR1. 图2 克隆质粒酶切电泳结果（略） Fig 2 Result of cloned plasmid cut with NcoI and SmaI（略） 2.3 测序结果与基因库比较结果 测序结果见Fig 3，与基因库比较，克隆片段位于protein kinase domain 区域, 无跨膜区域与信号区域，为FGFR1的可溶性部分. Fig 3 测序结果（略） Fig 3 Result of sequencing （略） 2.4 蛋白电泳与Western Blot结果 蛋白电泳出现强的表达带(Fig 4)，测量产物混合物中表达蛋白浓度为328%,Western Blot结果证实表达带为目标蛋白(Fig 5). 1:Protein marker; 2:Expressed protein of Mr 28 000 in RTS ; 3:Expressed protein in DH5a Ecoli.; 4:DH5a Ecoli. control. 图4 蛋白电泳结果 （略） Fig 4 Result of SDSPAGE （略） 1,3: Positive bands; 2:Positive control; 4,5:Negative control. 图5 Western blot结果 （略） Fig 5 Result of Western Blot（略） 3 讨论 因慢性排斥反应造成的AGA(accelerated graft arteriosclerosis)是导致器官移植的患者死亡与移植失败的主要原因1-4.大量证据表明，成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors, FGFs）参与损伤后血管的重建反应5.FGF1与FGF2从损伤的血管内皮细胞中释放出来，加速AGA产生.sFGFR1（soluble FGF receptor1），缺少跨膜与细胞质结构域，被认为能够阻断FGF与细胞表面受体的结合等，可能具有抑制AGA发生的作用6. 本研究中，我们用RTPCR方法获取了sFGFR1基因片段，并克隆到pIVEX2.3 d载体.为了明确所获片段是否正确，我们对克隆产物进行了测序与基因库比较，确认克隆产物是sFGFR1基因.为了获取sFGFR1蛋白，我们利用最新的无细胞蛋白扩增技术，即RTS（rapid translation system）系统,对sFGFR1蛋白进行了表达，Western Blot结果证明sFGFR1获得高效表达并且产物具有活性.RTS 系统是Roche公司近两年建立的一种新的无细胞蛋白质表达系统.在1 mL的反应液中可产生5 mg的目标蛋白，此蛋白可直接运用于X衍射、NMR与STM进行的结构分析，与传统的大肠杆菌表达分离纯化系统相比，具有明显的优越性.此技术第一次抛开了大肠杆菌，可直接用PCR产物表达相应蛋白，而且有非常高的效率，此技术将会在蛋白组研究领域与生物技术领域引发一场新的革命7. 本研究中，我们成功地克隆了sFGFR1基因，并在RTS系统中进行了高效表达具有活性的蛋白产物，为深入研究sFGFR1在器官移植排斥反应中的作用奠定了基础. 【参考文献】 1 Weis M, Von Scheidt,W. Coronary artery disease in the transplanted heartJ.Annu Rev Med,2000；51(1):81-100. 2 Paul LC. Pathophysiology of chronic renal allograft rejectionJ. Transplant Proc, 1999； 31:1715-1716. 3 Safian RD. Accelerated atherosclerosis in saphenous vein bypass grafts: A spectrum of diffuse plaque instabilityJ. Prog Cardiovasc Dis, 2002; 44(6): 437-448. 4 Bundy RE, Marczin N, Birks EF, Chester AH, Yacoub MH. Transplant atherosclerosis: Role of phenotypic modulation of vascular smooth muscle by nitric oxideJ. Gen Pharmacol, 2000; 34(2): 73-84. 5 Fellstrom B, Backman U, Larsson E, Wahlberg J. Accelerated atherosclerosis in the transplant recipient: Role of hypertensionJ. J Hum Hypertens, 1998; 12(12): 851-854. 6 Capron L, Grateau G. Accelerated arterial disease in renal transplant rec