FasL受体在突出腰椎间盘髓核细胞中的表达及意义.doc

FasL受体在突出腰椎间盘髓核细胞中的表达及意义【摘要】 目的：检测突出的腰椎间盘髓核中FasL受体的表达情况，探讨其与腰椎间盘突出症发生与发展的关系。方法：根据美国矫形外科学会（AAOS）及国际腰椎研究会（ISSLS）分类，将20例术中取出的腰椎间盘突出症患者髓核标本分成退变组（10例）、脱出组（10例），并以7例外伤性脑死亡青年患者作为正常对照组，应用免疫组化法检测髓核中FasL受体表达情况并通过电镜查找凋亡细胞。结果：（1）FasL受体主要定位于细胞膜，呈均匀的棕黄色细颗粒状或粗细不等；（2）3组FasL阳性表达率明显不同（P<0.05）；（3）Fas阳性表达率的高低同年龄有关（r=0.4102，P<0.05），但与性别及病程无关；（4）电镜可观测到细胞凋亡的一些形态学变化。结论：腰椎间盘、突出髓核细胞中存在FasL受体的表达，突出类型不同，FasL受体表达的程度也不同，其异常表达诱导了髓核细胞的凋亡，可能在腰椎间盘突出症的发病过程中起着重要作用。 【关键词】 腰椎间盘突出症；髓核细胞；凋亡；FasL；免疫组织化学 Abstract Objective: To investigate the cell type that expressed gene proteins FasL and the evidence of apoptosis of the disc cells in herniated lumbar disc tissues. Methods: Twenty herniated lumbar disc tissues(contained disc n=10 and noncontained disc n=10)and seven normal disc tissues were examined to investigate the cell type that expressed FasL and any evidence of apoptosis of the disc cells by using immunohistochemical S-P method and under electron microscope respectively. The percentage of FasL-positive disc cells was calculated and compared with clinical and radiologic data.Results:（1）FasL was expressed in the cell membrane of the disc cells.（2）There was a significant difference in the percentages of FasL-positive disc cells among the contained, noncontained and normal discs(P<0.05).（3）The percentages of FasL-positive disc cells correlated significantly with the patients ages(r=0.4102，P<0.05)， but not with the sex,duration of sciatica(P>0.05). There was some evidence of apoptosis of the disc cells under electron microscope.Conclusion: The expression of FasL on disc cells in herniated disc tissue is identified. The current results indicate that the abnormal expression of FasL on disc cells may lead to FasL-mediated apoptosis. The degrees of expression of FasL are varied depending on the types of herniation. Key words Protrusion of intervertebral disc; Apoptosis disc cell; FasL receptor; Herniated lumbar disc; Immunohistochemistry腰椎间盘突出症是腰腿痛最常见的原因之一，退行性变是基本致病因素，但其机理并不完全清楚，有证据表明，凋亡在椎间盘退变过程中可能起重要作用。本课题通过免疫组化的方法，研究FasL受体在髓核细胞中的表达情况及其与腰椎间盘突出症发生，临床与病理分类，病程、年龄、性别之间的关系，并通过电镜观察细胞的一系列形态学变化以查找细胞凋亡的一些实验依据，从而进一步探讨腰椎间盘退变的机理。 1 材料和方法 1.1 临床资料 收集南通大学医学院20002003年7月手术摘除并经病理证实的腰椎间盘标本20例，男12例，女8例；年龄3055岁，平均42.3岁；病程340周，平均15.1周。其中合并有腰椎管狭窄、多节段椎间盘突出及腰椎间盘复发者排除在外，按照美国矫形外科学会（AAOS）及国际腰椎研究会（ISSLS）分类1，腰椎间盘突出症分为退变型、膨出和突出型、脱出型，我们将脱出型单独列出来，把其余的类型称为退变型腰椎间盘突出，并以7例车祸致脑死亡青壮年患者（无腰椎间盘突出病史）作为对照。 1.2 试剂及仪器 S-P试剂盒为Zymed公司（美国）产品，即用型兔抗人FasL单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品。LEICA脱水机、LEICA包埋机、LEICA切片机均为德国LEICA公司产品。 1.3 方法 1.3.1 免疫组化染色 新鲜的髓核组织用10%甲醛固定24小时，LEICA脱水机脱水浸蜡，LEICA包埋机包埋制成蜡块，LEICA切片机连续切取5m厚的切片4张，最后一张留作HE染色。所有标本均在同一条件下，采用S-P法染色，具体步骤按：石蜡切片脱蜡3%过氧化氢清除内源性过氧化物酶活性抗原修复血清封闭加工作浓度为150的一抗加一滴酶标记的二抗加链霉素亲生物素-过氧化物酶溶液染色DAB显色苏木素复染，中性树胶封固。 1.3.2 表达FasL的髓核细胞计数 在光镜400倍视野下，每个标本选取3张切片，每张切片观察10个视野，最后计算出每个标本表达FasL的阳性细胞数及总细胞数，计算阳性率。 1.3.3 电镜观察 从新鲜髓核组织中切取1 mm1 mm1 mm大小标本，加入4%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，Epon812环氧树脂包埋，半薄切片定位，LKB-V超薄切片机超薄切片，铀-铅复染，JEOL JEM-100S透视电镜观察。 1.4 统计学方法 所有数据采用Stata7.0统计软件处理，多组计量资料用方差分析，两两比较用Scheffe法，等级资料用Spearman秩相关分析，检验水准=0.05。 2 结 果 2.1 FasL受体表达 FasL受体主要定位于细胞膜，呈均匀的棕黄色细颗粒状或粗细不等，阴性细胞胞膜及胞浆不着色，胞核呈紫蓝色（图1、2）。FasL受体表达阳性情况见表1。 2.2 FasL受体在髓核细胞的表达相关因素分析 运用Spearman等级相关发现，FasL的阳性表达率同年龄有关(rs=0.4220，P0.05) ,同性别和病程则无关（P>0.05）。 2.3 髓核细胞凋亡的电镜观察 退变组和脱出组中每个标本几乎均能找到13个凋亡细胞（图3），表现为细胞核染色质固缩，集聚至核周边呈月牙型斑块；胞浆浓缩；与胞膜融合形成膜表面泡状突起；受损细胞体积缩小，与临近正常细胞脱离，随后细胞膜内陷，将细胞分割成多个膜包小体，称凋亡小体，形成后可迅速被吞噬。 3 讨 论 细胞凋亡（apoptosis）是Kerr等于1972年首次提出的，是多细胞生物维持自身稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，又称为程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）2。机体通过细胞凋亡消除损伤、衰老与突变的细胞，以维持生理平衡，是一种主动的有程序的细胞死亡过程。研究表明，它与胚胎发育、器官的发育与退化、免疫、造血、细胞群体稳定等生理过程有着极其重要的关系3。 退变是腰椎间盘突出症的基本病理因素，但具体机制尚不明确。近年来，一些学者认为，凋亡机制可能参与髓核细胞退变、吸收的过程。Fas作为一种明确的凋亡启动蛋白分子，属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族4，是一种型跨膜蛋白，分子量为45 kDa。它广泛表达于活化的T细胞、B细胞、肝胆细胞和卵巢上皮细胞等多种细胞类型。表达Fas的细胞与相应抗体或其自然配体FasL的结合，可导致Fas死亡域的自聚和（或）交联5，激活多种蛋白酶或内源性核酸内切酶，从而诱发快速的细胞凋亡。 FasL属型细胞表面糖蛋白，分子量40 kDa。在激活的T细胞、自然杀伤细胞、免疫赦免区如睾丸的Sertali细胞、眼的角膜上皮细胞及视网膜中均可检测到FasL的存在6。实验发现腰髓核细胞中存在有FasL受体的表达，FasL受体主要定位于细胞膜，呈均匀的棕黄色细颗粒状或粗细不等，其中表达FasL的髓核细胞阳性率脱出组为77%、退变组61%、对照组30%，三者间有显著差异。上述发现表明FasL表达程度的高低与腰椎间盘突出症的发病有着密切关系，而腰椎间盘突出的类型不同，表达程度也不一样。 由于凋亡常不同步地发生在单个或小群细胞中，细胞内降解过程发生迅速，一般在数分钟内即完成降解，而且不引起组织炎症反应，所以很难对凋亡过程进行观察5。在细胞凋亡发展过程中最明显的实验证据是在光镜和电镜下观察到的一系列形态学变化，因为凋亡发生很快，所以很难找到典型的凋亡细胞，因此如果在一群细胞中能发现有典型的凋亡细胞存在，则提示在这群细胞中有高的凋亡率的发生6。本实验中突出的椎间盘标本几乎都能发现有典型凋亡细胞存在，而对照组则很少发现，我们把此种现象同FasL受体在髓核细胞中的表达情况结合起来，可以认为在突出的髓核组织中存在着由FasL介导的较高细胞凋亡发生。 研究表明，细胞凋亡可以造成退变椎间盘中细胞数量减少7，8，同样支持凋亡机制可能参予腰椎间盘突出症的发生发展。FasL受体在腰椎间盘突出症患者髓核细胞中高表达，说明其参与诱导了髓核细胞的凋亡，可能在腰椎间盘突出症的发病过程中起重要的作用9，10。因此目前尚不能说明细胞因子在此内环境下抗细胞凋亡的作用，但是为临床上防治椎间盘退变提供了一条新的思路。【参考文献】 1 Huk OL, Zukor DJ, Antoniou J, et al. Effect of pamidronate on the stimulation of macrophage TNF-alpha release by ultra-high-molecular-weight polyethylene particles:a role for apoptosisJ. J Orthop Res， 2003,21(1):81-87.2 Rogers MJ. New insights into the molecular mechanisms of action of bisphonatesJ. Curr Pham Des, 2003,9(32):2643-2658.3 Im CI, Qureshi SA, Kenney J, et al. Osteoblast proliferation and maturation by bisphosphonatesJ. Biomaterials, 2004, 25(18):4105-4115.4 Debatin KM. Apoptosis pathways in cancer and cancer therapyJ. Cancer Immunol Immunother, 2004,53(3):153-159.5 Boyce BF, Li P, Yao Z, et al. TNF alpha and pathologic bone resorptionJ. Keio J Med, 2005,54(3):127-131.6 Holen I, Shipman CM. Role of osteoprotegerin(OPG) in cancerJ. Clin Sci(Lond), 2006,110(3):279-291.7 张 梅，李 干，陈朝晖，等. 马钱子碱对一氧化氮诱导软骨细胞凋亡的影响J. 中国临床康复，2003，7（26）：3554-3555.8 Costouros JG, Dang AC, Kin HT. Comparison of chorrocyte apoptosis in vivo and vitro following acute osteochondral injuryJ. J Orthop