Fn、HSP70在冠心病猝死心肌中表达的诊断意义.doc

Fn、HSP70在冠心病猝死心肌中表达的诊断意义 作者：孙忠国 张凡 成日青 张九鸿【摘要】 目的： 探讨冠心病猝死心肌组织Fn、HSP70染色改变，为法医学鉴定冠心病猝死提供客观依据。方法： 选择35例冠心病猝死案例、30例冠心病死亡案例以及32例非冠心病死亡案例，用免疫组化方法对比检测纤维连接蛋白（Fibronectin Fn）和热休克蛋白70（heat shock protein70 HSP70）的表达。结果： 纤维连接蛋白在35例冠心病猝死案例、冠心病死亡案例以及非冠心病死亡案例中均有不同程度的阳性表达，且冠心病组的表达水平明显高于冠心病猝死组和非冠心病死亡组（P<0.05）；冠心病猝死组的表达水平明显高于非冠心病死亡组（P<0.05）；HSP70在冠心病猝死案例、冠心病死亡案例组呈阳性表达，冠心病组表达水平明显高于冠心病猝死组（P<0.05），非冠心病死亡组均呈阴性表达；Fn在冠心病猝死组中的表达与HSP70呈明显正相关（P<0.05）。结论： 纤维连接蛋白和HSP70的阳性表达是心肌缺血和损伤的灵敏指标，对推断冠心病猝死具有一定的实际应用价值。 【关键词】 冠心病猝死；纤维连接蛋白；热休克蛋白70；免疫组织化学 【ABSTRACT】 Objective: To investigate the change of Fn HSP70s expressions in sudden coronary death and search for reasonable basis for forensic pathology to diagnose sudden coronary death.Methods: The expressions of Fn、HSP70 proteins were detected by immmunohistochemistry method in thirtyfive cases died of sudden coronary death、thirty cases died of coronary heart disease and thirtytwo cases died of disease.Results: All cases have various level expression of Fn and the expression level of coronary heart disease is higher than that of sudden coronary death among nosudden coronary death（P<0.05）;the expression level of sudden coronary death is higher than that of nosudden coronary death（P<0.05）;HSP70 have positive expresssion only in sudden coronary death and coronary heart disease The expression of HSP70 in coronary heart disease is higher than that of sudden coronary death. There is positive correlation between the expression of HSP70 and Fn in sudden coronary death.Conclusion: Fn and HSP70 are sensitive index to myocardiums injury and anemic so they have practical value for forensic pathology to diagnose sudden heart death. 【KEY WORDS】 Sudden Coronary Death; Fn; HSP70; Immunohistochemistry 猝死者往往预先没有任何征兆或症状和体征极轻微，死亡意外而且突然，无有医生在场，因此易引起怀疑，而冠心病是猝死的常见原因，常规病理学方法观察缺乏典型的形态学依据，给冠心病猝死的诊断增加了难度，目前基层法医工作者对冠心病猝死的鉴定主要还是依赖于排除法，即在排除暴力、中毒及其他疾病致死的基础上，结合冠状动脉明显的粥样硬化斑块病变作出冠心病猝死的鉴定。纤维连接蛋白和HSP70是两个对组织损伤较为敏感的指标，在急慢性炎症过程中都存在阳性表达，而且冠心病猝死心肌的病理变化肯定与长期存在明显症状的冠心病死亡心肌以及非冠心病死亡心肌之间存在不同，因此我们应用免疫组织化学方法检测纤维连接蛋白和HSP70在冠心病猝死、冠心病死亡和非冠心病死亡心肌中的表达，为冠心病猝死提供法医学鉴定客观依据。 1 材料与方法 1.1 尸检材料 选取近10年来我室受理检验的312起案件的97个心脏标本，冠心病猝死35例，男性25例、女性10例，年龄3560岁；冠心病死亡30例，男性18例、女性12例，年龄4568岁；非冠心病猝死32例，男性15例、女性17例，年龄27岁58岁；心脏重量为396.0979.35g，左心室壁厚1.480.25cm，右心室壁厚0.480.12cm。根据心脏大体解剖和HE染色观察结果，参照1995年美国心脏病学会动脉粥样硬化病变委员会的分型1,2，将97例心脏标本按病变程度不同分为型16例（其中冠心病猝死12例，非冠心病猝死4例），型20例（冠心病猝死9例，冠心病死亡1例，非冠心病猝死10例），型25例（冠心病猝死9例，非冠心病猝死10例，冠心病死亡6例），型18例（冠心病猝死5例，非冠心病猝死5例，冠心病死亡8例），型11例（冠心病死亡10例，非冠心病猝死1例），型7例（冠心病6例，非冠心病猝死1例）。尸检均在死亡后12h内进行。 1.2 实验方法及试剂 每例心脏标本沿血流方向剖开，10%甲醛固定23d后于心尖、左心室前壁、后壁和侧壁、室间隔、窦房结、房室结处各取一组织块，常规石蜡包埋、切片，切片厚4m，分别进行HE染色、Fn、HSP70免疫组织化学染色。 HSP70抗体为美国Sigma公司产品，克隆编号：BRM2；Fn抗体购自福建迈新试剂公司，单克隆抗体，二抗、三抗为SP复合物和山羊抗兔PV6001，购自北京中山试剂公司，按说明书严格进行操作，用试剂公司提供阳性片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。 1.3 主要免疫组化步骤 二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗，正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗 、三抗各1h DAB显色1015min，复染核脱水透明，中性树胶封片。 1.4 阳性表达图象分析 采用HIPAS100图象分析软件对所有切片进行图象分析，每张切片随机选取5个着色典型区域且不重复的视场，测量每个视场中阳性单位，取其均数即为该切片的表达水平，所有的结果都以均数标准差表示。 1.5 统计学方法 应用SPSS10.0统计软件进行统计学处理。不同组间表达率的比较采用Fisher精确概率法，各指标表达水平比较用t检验。 2 结果 2.1 HE染色观察 冠心病死亡组心肌细胞颗粒变性，出现收缩带，心肌细胞坏死纤维化，急性心肌梗死者，可见局部出血或淋巴细胞、中性粒细胞浸润，陈旧性梗死纤维瘢痕形成。冠心病猝死组心肌肥大变性，嗜伊红性强，细胞浆聚集呈颗粒状或细胞浆溶解呈空泡化，细胞核增大，染色质疏松。非冠心病猝死组型1例，型1例出现心肌细胞颗粒变性和陈旧性梗死纤维瘢痕形成外，其余病理变化同冠心病猝死组无明显组织学区别。 2.2 纤维连接蛋白及HSP70免疫组织化学染色结果 Fn及HSP70的阳性部位均为细胞浆。Fn在非冠心病猝死组、梗死组和猝死组的阳性表达率分别为11%（4/32）、95%（28/30）、77%（27/35），在各组标本中均有表达，且在非冠心病猝死组的表达率、表达水平明显低于梗死组和猝死组；猝死组表达率、表达水平低于梗死组，同时非冠心病猝死组的阳性表达水平较低，且阳性细胞的分布没有明显规律，猝死组阳性表达出现灶性分布特点，在病变动脉供血区域分布且表达水平高，而窦房结、房室结处未见阳性细胞，梗死组阳性表达呈现大片分布的特点，高水平表达，而且冠状动脉粥样硬化区域周围的心肌细胞出现强阳性表达，窦房结、房室结处心肌细胞散在阳性（见表1）。表1 纤维粘连蛋白在各组的不同表达注：*梗死组与猝死组比较；*梗死组与正常对照组比较；*猝死组与非冠心病猝死组比较。 HSP70仅在猝死组和梗死组有阳性表达，阳性率分别为67%（23/35）和85%（26/30），梗死组的阳性率、表达水平明显高于猝死组；同时梗死组的阳性表达在粥样硬化动脉严重区域周围的心肌细胞大片状高水平表达HSP70，心脏传导系统周围的心肌细胞阳性表达呈现灶性特点，而在猝死组的阳性表达仅存在于粥表2 HSP70在各组的不同表达 3 讨论 冠心病猝死的的主要病理改变为冠状动脉粥样斑块形成和心肌梗死，冠脉粥样硬化病变的总检出率以前降支最高，而且分布规律是左心多于右心，近端多于远端；目前法医病理学对冠心病猝死的鉴定主要还是依赖于排除机械损伤、中毒及其他疾病致死的基础上，结合冠状动脉明显的粥样硬化斑块病变作出冠心病猝死的鉴定，对冠状动脉病变较轻甚至形态正常的猝死，除外其它死因并高度怀疑冠心病猝死的案例诊断往往因为没有客观依据而十分困难，为寻找冠心病猝死的佐证我们选取确诊的冠心病猝死案例并与非猝死的冠心病案例、非冠心病猝死案例进行Fn和HSP70免疫组化对比染色，实验结果显示Fn与HSP70阳性表达对冠心病猝死的诊断有肯定意义。 Fn是机体内存在于血浆和细胞外基质的一种大分子糖蛋白，在心肌缺血、梗死过程中心肌细胞膜损害致通透性增高，血浆中Fn成分首先通过受损的毛细血管进入组织间隙，然后向受损的心肌细胞内扩散。有报道心肌发生缺血15min后在心肌细胞浆中即可出现Fn阳性反应3；Thornell等采用猪作动物模型，发现在心肌缺血30minFn即可在心肌细胞内出现，并用电镜证实Fn阳性的心肌细胞已发生不可逆损伤4,5。我们实验的35例冠心病猝死案例中，16例Fn染色心内膜下至心肌全层心肌细胞均有阳性表达，包括血管平滑肌和乳突肌阳性反应细胞数目明显增多，同时实验显示正常组表达水平低于梗死组和猝死组，推测可能这是由于冠状动脉粥样硬化病变引起的管腔狭窄或阻塞导致的冠状动脉供血区心肌细胞缺血、坏死，诱导炎性细胞游走渗出到该区域，发生了不可逆性损伤，属较为经典的冠心病心肌梗死猝死案例；而且猝死组表达水平低于梗死组，可能由于机体对动脉缺血的反应存在时间依赖性，猝死组机体对梗死的反应时间较为短暂；粥样硬化周围区域出现阳性表达而传导系统周围散在阳性可能与不同解剖部位的耐受性有关。 HSP70在正常细胞中水平较低，一般也检测不到。近年研究成果表明，不仅在心肌早期缺血再灌流动物模型上可观察到HSP70的表达增加，临床心脏外科术及冠状动脉旁路移植术后也能检测到HSP70的阳性表达68，而这些都被证明是心脏手术后心肌缺血再灌流的结果。我们实验中HSP70心内膜下弱阳性表达，而边缘区阳性反应较强，呈棕黄色阳性着色。这可能是因为冠状动脉发生较长时间的痉挛、缺血突然缓解后，心肌的再灌流使心内膜下心肌组织损害严重，并出现不可逆性损伤，导致细胞功能障碍，细胞内蛋白质难以继续合成所致。此时边缘区HSP70的阳性表达增强，则可能是因为此处存在着一定的氧梯度，使该区心肌处于相对缺氧状态，促使局部存活细胞合成HSP70。这与肖俊辉等在家兔早期心肌缺血再灌流动物模型实验中所观察到的基本一致9,10，其中3例冠状动脉粥样硬化斑块和HE染色病理形态学变化均不显著，而既往有典型的心绞痛病史及心肌缺血的心电图改变而猝死者，纤维连接蛋白免疫组织化学染色心内膜下至心肌全层阳性反应细胞数目表达较多，HSP70免疫组化染色心内膜至心肌全层阳性反应细胞数目较少表达。这可能是由于冠状动脉严重痉挛突然缓解后心肌的再灌流诱发了致命性心律失常乃至猝死所致。 Fn和HSP70作为心肌早期缺血和缺血再灌流时的敏感的细胞反应指标，在我们的实验中两者的表达水平在猝死组中呈现明显的正相关，可能二者在冠心病猝死病理变化中起协同作用，随病变时间的延长表达水平明显提高，能具体反应心肌损伤细胞内源性保护机制发挥作用的过程，因而在法医病理学中心肌组织中Fn和HSP70免疫组化观察对推断冠心病猝死具有一定的应用价值。【参考文献】 1 Myerburg RD, Kessler KM l.Lifethreatening ventricular arrhythmias in patients with silent myocardial ischemiadue to coronaryartery spasmJ.N EnglJ Med,1992,326（22）:145114552 Nappo A,Varesc C,Rossi L, et al.Sudden cardiac death innonprofessional athletesJ.pathologica,1997,89（5）:5175223 赵子琴主编.法医病理学M.第3版 北京：人民卫生出版社,2004 .3703744 Fberhardt F,Mehlhorn K.Structural mrocardial changes after coronary artery surgeryJ.Eur J Cli Invest,2000,30（11）:9389465 Corr PB,Witkowski FX.Potential electrophysiologic mechanisms responsible for dysrhythmias associated with reperfusion of ischemic myocardiumJ.circulation,1983,68（2）:16246 Dapunt OE,Raji MR,Jeschkeit S, et al.Intracoronary shunt insertion pr