cIAP2与Smac基因在白血病中的表达及其临床意义.doc

c-IAP2与Smac基因在白血病中的表达及其临床意义【摘要】 为了研究c-IAP2及其拮抗素Smac基因在白血病中的表达及对成人急性白血病（AL）患者的预后意义，采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测103例白血病患者c-IAP2、Smac的mRNA表达水平，20名健康人为正常对照，K562、Kg-1a细胞株为阳性对照。结果表明： c-IAP2、Smac在初治AL中的表达较正常对照组明显升高，两者的表达为高度正相关，治疗缓解后c-IAP2、Smac的表达明显下降，与初治AL组有明显差异（P<0.05），复发后c-IAP2、Smac基因的表达又复升高。c-IAP2 mRNA和Smac mRNA在慢性粒细胞性白血病慢性期（CML-CP）组的表达率和表达水平均高于正常对照组，但无统计学意义（P>0.05）。在初治AL患者中，c-IAP2、Smac表达阳性的患者缓解率均低于表达阴性的患者。 结论： c-IAP2 mRNA、Smac mRNA过度表达和急性白血病的发病呈正相关；c-IAP2 、Smac高表达的患者完全缓解率低，预后不良；c-IAP2、Smac可作为急性白血病的发病、复发及预后判断的指标之一。 【关键词】 白血病Expressions of c-IAP2 and Smac Gene in Leukemia and Their Clinical SignificanceAbstract To investigate the expressions of c-IAP2 and Smac in leukemia and their prognostic significance in adult patients with acute leukemia (AL)，the mRNA expressions of c-IAP2 and Smac in 103 AL adult patients were measured by semi-quantity reverse transcription polymers chain reaction (RT-PCR).Other 20 adults were selected as normal controls (NC)，K562 and Kg-1 cell lines were employed as positive control.The results showed that the expressions of c-IAP2 and Smac in de novo AL patients were higher than those in NC，while they decreased in patients at complete remission (CR). In relapsed patients，the expressions of c-IAP2 and Smac increased again.The mRNA expression of c-IAP2 and Smac in CML-CP were higher than that of NC，but no statistical significance was found (P>0.05).In AL patients，the CR rate of c-IAP2+ and Smac+ cases were lower than those of c-IAP2-and Smac-cases. It is concluded that overexpression of c-IAP1 and Smac may play a synergic role in the pathogenesis of AL，and there is a positive correlation beween them. The c-IAP2 and Smac expressions are associated with remission rate in AL，while the patients with high level of c-IAP2 or Smac have low remission rates. It seems that c-IAP2 and Smac serve as markers of poor prognosis in AL.Key words leukemia; c-IAP2 gene; Smac gene; apoptosis白血病为最常见的肿瘤之一，虽然骨髓移植和联合化疗改善了其预后，但一部分患者仍很难达到完全缓解或缓解后复发。目前的研究显示，肿瘤的发生、发展与细胞凋亡的紊乱密切相关。本研究应用RT-PCR研究白血病患者在初治、化疗缓解后、复发时c-IAP2、Smac基因水平的变化，探讨c-IAP2、Smac在白血病中表达的相互关系，对白血病发病机制及预后因素作初步探讨。材料和方法病例选择研究对象包括86例成人急性白血病（AL）患者(初治急性白血病患者62例、复发9例、缓解15例)和17例慢性粒细胞白血病（CML-CP）患者，20名健康人作为正常对照组（NC），K562、Kg-1细胞株作阳性对照。患者均为我院血液内科2003年2月-2004年12月期间住院和门诊随访的病人，经过骨髓细胞形态学、组织化学、免疫表型、融合基因、染色体等检查确诊，均符合FAB诊断标准。初治的患者化疗1疗程后复查骨髓象判断是否完全缓解（CR），CR的判断标准参照张之南主编的血液病诊断及疗效标准。单个核细胞的分离取骨髓液4 ml，缓慢加至等量的淋巴细胞分离液上，1 200g离心20分钟，分离中间的单个核细胞，加入3 ml 0.84氯化胺，吹打混匀，静置5分钟，裂解混入的红细胞，900g离心5分钟，弃去上清液，用PBS液洗涤2遍，-80保存待用。细胞总RNA的提取用TRIZOL提取细胞总RNA。在紫外透射仪上显示有28S、18S（部分可见到5S）两条rRNA，说明提取的RNA完整。cDNA合成细胞总RNA 2 l，50 U/l RNasin 0.5 l，5逆转录反应缓冲液3 l，10 mmol/L dNTP 1.5 l，50 g/ml随机引物1 l，AMV逆转录酶15 U，25 mmol/L MgCl2 0.5 l。42反应90分钟，95 5分钟后终止反应。引物设计c-IAP2正义引物: 5-TCCTAGCTGCAGATTCGTTC-3； 反义引物: 5-GGTAACTGGCTTGAACTTGAC-3。扩增片段746 bp。 Smac正义引物： 5-CCTGTGTGCGGTTCCTATTGC-3； 反义引物：5-TGATTCCTGGCGGTTATAGAG-3。扩增片段： 399 bp。PCR反应反应体系包括逆转录产物2 l，10 pmol/l 上、下游引物各2.5 l，10 mmol/L dNTP 0.5 l，10PCR反应缓冲液2.5 l，25 mmol/L MgCl2 1.5 l，Taq DNA聚合酶1.25 U，其余以DEPC水补足至25 l。c-IAP2的扩增条件为： 94 2分钟，1个循环，94 45秒，54 45秒，72 45秒，35个循环。最后72 延伸10分钟。Smac的扩增条件为： 94 40秒，54 60秒，72 60秒，32个循环。最后72延伸10分钟。PCR产物分析扩增产物经2琼脂糖电泳（98 V，50分钟）后，紫外透射仪下观察并照相，并在读胶仪Eagle Eye上进行扫描定量。以相关基因与内对照-actin的比值代表其mRNA表达水平。治疗方案对于初治AML患者采用标准DA化疗方案（阿糖胞苷、柔红霉素）诱导缓解。复发AML患者分别采用AME（阿糖胞苷、米托蒽醌、足叶乙甙）、IA（阿糖胞苷、去甲氧柔红霉素）等化疗方案。M3患者采用全反式维甲酸（ATRA）或ATRA与三氧化二砷（As2O3）合用或以ATRA为主，联合应用小剂量DA（阿糖胞苷、柔红霉素）、HA（阿糖胞苷、高三尖杉酯碱）方案诱导分化治疗。复发、难治的M3应用三氧化二砷治疗。对于ALL患者选用化疗方案VITP（长春地辛、异环磷酰胺、吡喃阿霉素、泼尼松）治疗。对于CML患者应用羟基脲和小剂量化疗加干扰素治疗。统计学处理结果用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理。分别应用t检验、2检验和相关分析。P<0.05有统计学意义。结 果正常对照组和AL患者组中c-IAP2 mRNA的表达c-IAP2 mRNA在正常人中的表达率为0.0%（20例全部阴性），基因相对表达水平（c-IAP2/-acitn）为0，平均水平为0；在初治的AL患者62例中，c-IAP2 mRNA的阳性率为58.1%（36/62），表达水平为0-1.471，平均水平为0.494，其表达水平较正常对照组明显升高，差异具有显著性（P=0.000）。复发组的阳性率为66.7%（6/9），表达水平0-1.325，平均表达水平为0.554，与正常对照组比较明显升高，差别有显著性（P0.010）；较初治AL组表达水平高，但无统计学意义（P0.741）。在15例缓解组中，c-IAP2 mRNA的阳性表达率为20.0%（3/15），表达水平0-1.571，平均表达水平0.202，与正常对照组相比表达水平高，但无统计学意义（P0.114）；然而，表达水平低于初治AL组，且差别有显著性（P0.044）。电泳结果见图1。正常对照组和AL患者组中Smac mRNA的表达Smac mRNA在正常人中的表达率为5.0（1/20），基因相对表达水平为0-0.462，平均水平为0.031。在初治AL组Smac mRNA的阳性率为74.2（46/62），表达水平为0-1.982，平均表达水平为0.554，高于正常对照组，有显著性差异（P0.000）。在复发的9例患者中，Smac mRNA表达阳性者为7例（77.8%），平均表达水平为0.583，高于正常对照组，差别有显著性（P0.003），比初治AL组高，但无统计学意义（P0.158）。在15例缓解组中，SmacmRNA的阳性表达率为26.7（4/15），表达水平为0-1.263，平均水平为0.244，与正常对照组相比较表达水平高，但无统计学意义（P0.07）；但其表达水平低于初治AL组，且差别有显著性（P0.009）。电泳结果见图2。AL患者c-IAP2和Smac mRNA表达水平的相关分析c-IAP2和Smac双阳性的患者33例（53.2%），双阴性的12例（19.4%），Smac+/ c-IAP1-或Smac-/ c-IAP1+的患者17例（27.4%），对初治的62例AL患者的c-IAP2和Smac mRNA表达水平进行直线相关分析，发现两者的mRNA水平成正相关（r0.472，P0.000）。c-IAP2和Smac mRNA在CML中的表达我们应用RT-PCR检测了17例CML慢性期患者的c-IAP2和Smac mRNA的表达，其中慢性期c-IAP2的表达阳性率为5.9（1/17），表达水平0-0.230，平均表达水平0.019，高于正常对照组，但无统计学意义（P0.332）。Smac mRNA在CML慢性期的表达率为17.6% (3/17)，表达水平0-0.930，平均表达水平0.112，也高于正常对照组，但无统计学意义（P0.479）。c-IAP2和Smac mRNA的表达与缓解率的关系62例初治AL患者中51例可进行疗效评估（3例早期死亡，5例未治疗，3例治疗过程中自动出院）。其中，c-IAP2组缓解率为62.1%(18/29），c-IAP2-组缓解率为90.1（20/22）。c-IAP2-组的缓解率高于c-IAP2组，进行2检验分析发现，差别有显著性（27.674，P0.006）。Smac组的缓解率为60.0（21/35），明显低于Smac-的缓解率87.5（14/16），两组之间有显著性差异（25.472，P0.019）。讨 论凋亡抑制蛋白（IAP）是一族在人类进化过程中相当保守的凋亡抑制蛋白，所有IAP成员都含有1-3个杆状病毒凋亡抑制重复蛋白（baculovirus IAP repeat，BIR）结构，与抗凋亡作用密切相关。c-IAP2是IAP家族的主要成员，定位于11q22-23，含有3个BIR结构域和一个ring结构域及一个card结构。c-IAP2抑制凋亡的作用机制是直接抑制caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程中的位于下游的caspase-3、caspase-7、caspase-9及caspase-9前体的活性。Smac/ DIABLO (second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding protein with low PI)则是一种新发现的促凋亡蛋白，其基因位于12号染色体长臂，由7个外显子组成。Smac发挥促凋亡作用的机理是和IAP结合，解除IAP对caspase的抑制作用。在正常组织中c-IAP2在肾、小肠、肝、肺中高表达，而在中枢神经系统中表达最低1。Smac在正常组织睾丸中表达水平最高，在心、肝、肾、脾、前列腺、卵巢中也有较高表达，但在脑、肺、胸腺以及外周血粒细胞中则低表达。在人类肿瘤组织中，c-IAP2和Smac的表达也很为广泛。Tamm等2曾研究了c-IAP2在60多种肿瘤细胞系中的表达情况，c-IAP2广泛表达于各种肿瘤细胞中，34(52%)种肿瘤细胞株中都有不同程度的表达。Adrain等3则发现Smac mRNA也在肿瘤细胞中广泛表达，包括源于单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞及上皮样细胞的肿瘤细胞系，同时，在293、Jurket、HeLa、MCF-7等多种细胞株中也发现有Smac的表达4。在我们的研究中，c-IAP2和Smac基因在两种白血病细胞株Kg-1、K562也都表现出异常高的表达水平。在初治AL组，c-IAP2mRNA的表达率和表达水平明显高于正常对照组，且有显著性差异（P<0.05）；其拮抗素Smac mRNA的表达率和表达水平也明显升高，两者表现为高度正相关，提示c-IAP2和Smac基因的异常高表达和白血病的发病密切相关。而在17例CML中c-IAP2和Smac基因的表达水平均高于正常对照，但无统计学意义（P>0.05），我们认为在CML的发病过程中两者并不起主要的作用。AL经治疗达到完全缓解后，c-IAP2和Smac mRNA的表达明显下降，与正常对照组无显著性差异，而在9例复发患者，两者的表达水平再次升高，明显高于正常对照组和缓解组，而与初治组无明显差异，所以我们认为，可以通过对c-IAP2和Smac基因表达的监测来判断急性白血病的病情变化，它们表达水平的增高是AL患者复发的高危因素。 前面已经提到，Smac发挥促凋亡作用是通过和IAP作用，它解除IAP对caspase-9 、3、7的抑制作用，进而引起这3种caspase相继被激活并发生caspase的级联放大反应，从而使凋亡得以延续。但是，Smac并不引起正常的细胞发生凋亡，同时不能对抗bcl-2对凋亡的抑制作用3、5。在我们的研究中发现，Smac mRNA在急性白血病细胞中的表达明显增高，和c-IAP2 呈高度正相关。我们认为，白血病的患者出现抗凋亡和促凋亡基因的协同升高，是因为Smac在细胞凋亡中起到了解除IAP对凋亡的抑制作用，在正常细胞中它不诱发凋亡。 c-IAP2 mRNA 的表达的升高，可能是通过某种信号的刺激而引发Smac表达的相应的升高，以抑制c-IAP2的过度表达，因此Smac基因在AL中的表达升高是c-IAP2表达升高的一种伴随现象。 在研究中我们还发现c-IAP2和Smac表达阴性患者的完全缓解率高，而表达阳性患者的完全缓解率低，预后不良。因此我们认为，c-IAP2和Smac还可以作为判断预后的重要指标。关于 c-IAP2高表达造成CR率低的原因，我们认为可能是c-IAP2高表达后造成白血病细胞对化疗药物的敏感性下降所致。抗肿瘤药物杀伤癌细胞多数是通过凋亡路径来实现的，肿瘤对抗癌药物的耐药是由于凋亡信号的缺失6。目前已知多种凋亡抑制因子可以降低肿瘤细胞对化疗的敏感性，如 bcl-2和c-IAP1的高表达的肿瘤细胞对抗癌药物耐药，由此我们推测，c-IAP2的高表达是造成白血病细胞耐药的又一重要因素。综合前述，c-IAP2和Smac在初治AL表达增高，缓解后表达减少或转阴，复发时再次增高。同时，c-IAP2和Smac表达阳性的患者缓解率低，且易复发。因此，c-IAP2和Smac可作为判断白血病患者预后的独立因素。【参考文献】 1Young SS，Liston P，Xuan JY，et al. Genomic organization and physical map of the human inhibitors of apopt